Физические методы исследования биологических объектов

  До них  належать:

-спектральні методи

   а)ультрафіолетова  та видима спектроскопія,

   б)флуоресценція,

   в)інфрачервона  спектроскопія,

   г)спектроскопія  комбінаційного розсіяння,

   д)дисперсія  оптичного обертання,

   е)круговий  дихроїзм,

   є)полум’яна спектрофотометрія,

   ж)електронний  парамагнітниій резонанс,

   з)ядерний  магнітний резонанс;

  -електрохімічні  методи

   а)полярографія,

   б)потенціометрія,

   в)кондуктометрія;

  -мас-спектрометрія;

  -манометрія;

  -поляриметрія.

Розглянемо ці методи більш детально. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3.Спектральний аналіз

.

Спектроскопія (спектральний аналіз) — область фізики, використовувана для ідентифікації з'єднань, дослідження складу, будови і кількісного аналізу індивідуальних речовин і багатокомпонентних систем

Спектральний аналіз — сукупність методів визначення складу (наприклад, хімічного) об’єкта, що базується  на випромінюванні спектрів взаємодії матерії с випромінюванням, включаючи спектри електромагнітного випромінювання, радіації, акустичних хвиль, розподілення по масам і енергіям елементарних часток и ін. Традиційно , розрізняють атомний і молекулярний спектральний аналіз, «еміссіний» за спектрами випромінювання і « абсорбційний » за спектрами поглинання, а також «масс-спектрометричний» за спектрами мас атомарних ичи молекулярних іонів.

Спектральний аналіз за оптичними спектрами атомів був запропонований в 1859 році Г. Кірхгофом і Р. Бунзеном. З їх допомогою гелій був відкритим на Сонцеі раніше, ніж на Землі.

Атоми кожного хімічного елемента мають строго визначені резонансні частоти, в наслідок чого саме на цих частотах вони випрмінюють чи поглинають світло. Це приводить до того, що в спектроскопі на спектрах видно лінії (темні чи світлі) в визначених місцях, характерних для кожної речовини. Інтенсивність ліній залежить від кількості речовини та її стану. В кількісному спектральному аналізі визнають склад визначуваної речовини за відносною ичи абсолютною інтенсивністю ліній ичи смуг в спектрах.

Оптичний спектральний аналіз характеризується відносною простотою виконання, відсутністю складної поіготовки проб до аналізу, незначною кількістю речовини (10—30 мг), необхідної для аналізу на велику кількість  елементів. Атомарні спектри (поглинання чи випромінюванняя или ) отримують переведенням речовини в пару  шляхом нагрівання проби до 1000—10000 °C. Для аналізу розчинів широко використовують вогонь чи плазму різноманітних газів.

 Спектральний  аналіз — чутливий метод і широко використовуеться в аналітичній хімії, астрофізиці, металургії, машинобудуванні, геологічній розвідці і ін.

  Однією із задач спектрофотометричного метода є кількісне визначення величин, які характеризують поглинання даною речовиною монохроматичного випромінювання різних довжин хвиль. Ці величини можуть бути використані як для якісної характеристики речовини, так і для кількісного визначення в розчині чи в суміші з іншими речовинами. В зв’язку з поділом електромагнітного спектра по довжині хвилі на певні області можна говорити про спектрофотометрію в інфрачервоній, видимій і ультрафіолетовій області. В ультрафіолетовій і видимій області проявляються електронні спектри молекул, в інфрачервоній області – коливальні спектри.

  В сучасних хімічних дослідженнях широко застосовують спектральні методи. Ці методи все більше застосовують в технічному аналізі хіміко-фармацевтичних препаратів, в аптечній практиці. Серед оптичних методів найбільш доступною, а тому і самою поширеною є видима і ультрафіолетова (УФ) спектрофотометрія, яка дозволяє на відносно нескладному обладнанні швидко і точно проводити кількісний аналіз речовин

 Спектрофотометричний метод аналіза ґрунтується на загальному принципі – пропорціональній залежності між світло поглинанням речовини, її концентрації і товщини поглинаючого шару. Для визначення концентрації розчинів спектрофотометричним методом використовують закон Бугра-Ламберта-Беєра: 

        (1) 

де С –концентрація  досліджуваної речовини у відсотках;

в – товщина  шара речовини в сантиметрах;

х – показник поглинання розчину, концентрація якого  дорівнює одиниці;

Д – оптична  густина.

Визначення оптичної густини проводять на фотоелектричних  спектрофотометрах.

Показник поглинання х визначають на основі визначення оптичної густини Д для розчинів з відомою концентрацією по формулі:

     (2)

При цьому, якщо концентрація С виражена в молях  на 1 л, то величина х називається  молярним показником поглинення а позначається символом ; якщо концентрація виражена в грамах на 100 мл розчину, то ця величина називається питомим показником поглинання і позначається символом  .

Таким чином, молярний показник поглинання представляє собою оптичну густину одномолярного розчину речовини при товщині шару 2см; питомий показник поглинання - оптичну густину розчину, що містить 1г речовини в 100 мл розчину при тій же товщині шару.

Якщо відоме значення х (у формі  , чи ) визначають концентрацію досліджуваних розчинів по величині оптичної густини Д, користуючись формулою (1). Спектрофотометричне визначення проводиться з використанням еталонів (стандартних розчинів). Питомий показник поглинання вичисляють на основі визначень величини оптичної густини розчину по формулі:

     (3)

Вимірювання оптичної густини розчину необхідно проводити при довжині хвилі Х_мах, яка відповідає максимальному поглинанню світла досліджуваним розчином. При цьому досягається найбільша чутливість і точність визначення (Х_мах знаходиться експериментально). Значення Х_мах вказується в методиках.

 Для визначення питомого показника поглинання готують ряд стандартних розчинів з відомою концентрацією досліджуваної речовини в даному розчиннику і для кожного вимірюють оптичну густину, потім розраховуються значення питомого показника поглинання. Знаючи величину питомого показника поглинання і на основі визначеної оптичної густини розчину аналізуємої речовини невідомої концентрації, можна розрахувати її вміст по формулі:

      (4)

 При виборі розчинника важливо, щоб він не поглинав в тій же області спектра, що і розчинена речовина.

Спектрофотометрія – визначення кількості речовини в забарвленому або в незабарвленому розчині по вимірюванні світопоглинання  хвиль певної довжини. Світопоглинання  вимірюють з допомогою фотоелемента по зміні сили фото потоку, який виникає в ньому, при падінні на фотоелемент світлового потоку, який пройшов через контрольний, а потім досліджуваний розчин. Вимірювання світопоглинання проводять в приладі спектрофотометрі. 
 

 

 
 

а)Спектроскопія в видимій та ультрафіолетовій області

  У органічній хімії або біохімії практично жоден експеримент не обходиться без застосування спектроскопічних методів. Вони широко використовуються для ідентифікації продуктів хімічних і ферментативних реакцій або складніших біологічних процесів виявлення проміжних з'єднань (і тим самим для отримання цінної інформації про механізми перетворень), дослідження кінетики і стереохімії хімічних реакцій, просторової структури і динаміки молекул і надмолекулярних систем, з'ясування будови знов виділених природних з'єднань і т.д.

  Спектроскопія в оптичній області спектру (ультрафіолетова, видима, інфрачервона) використовується перш за все в наступних випадках: 1) для визначення концентрації; 2) ідентифікації речовини; 3) визначення числа частинок в розчині (наприклад за допомогою ізобестичних крапок) Спектрофотометрія у видимій області і УФ-областях дозволяє оцінювати ступінь чистоти речовини, ідентифікувати по спектру різні сполуки, визначити константи дисоціації кислот і основ, досліджувати процеси комплексоноутворення.

  УФ-спектрофотометричне вимірювання проводять в розчинах. Як розчинники використовують очищену воду, кислоти, луги, спирти (метанол, етанол), деякі інші органічні розчинники. Розчинник не повинен поглинатися в тій чи іншій області спектра, що й аналізуюча речовина. Характер спектра (структура і положення полос поглинання) може змінюватися в різних розчинниках, а також при зміні рН середовища.

Методом УФ-спектрофотометрії  використовують для визначення ідентичності, чистоти і кількісного вмісту лікарських препаратів. Вивчення спектрів поглинання хімічних речовин з різною структурою дало можливість установити, що основними факторами, які обумовлюють поглинання світла, є наявність так званих хромофорів, т.б. ненасиченість (подвійні чи потрійні зв’язки), наявність карбонільної, карбоксильної, амідної, азо-, нітрозо-, нітро- та інших функціональних груп. Кожна функціональна група характеризується поглинанням в певній області спектра. Але є ряд факторів (присутність декількох хромофорних груп, вплив розчинника та ін.) приводять до зміщення смуг поглинання в сторону більших довжин хвиль (багатохромне зміщення) або в сторону коротких довжин хвиль (гіпсохромне зміщення). Крім зміщення може спостерігатися ефект збільшення (гіперхромний) чи зменшення (гіпохромний) інтенсивності поглинання.

В зв’язку з  цим для ідентифікації речовин  по її УФ-спектру застосовують метод  порівняння із спектром відомої речовини, одержаний в тих же умовах. Характеристикою  спектра поглинання речовини є положення максимумів (мінімумів) поглинання, а також інтенсивність поглинання, що характеризується величиною густини чи питомого показника поглинання при даній довжині хвилі.

Фізичні основи методу.

   З курсу загальної фізики відомо, що будь-яке електромагнітне випромінювання пов'язане з процесами, що відбуваються в атомах або молекулах. Здатність випромінювати і поглинати електромагнітне випромінювання є загальною властивістю всіх атомів і молекул. Випромінювання (поглинання) вельми виборне, тобто випромінювання тільки певної довжини хвилі даною молекулою інтенсивно поглинається, тоді як випромінювання інших довжин хвиль поглинається слабо або зовсім не поглинається. Крива залежності поглинання від довжини випромінюваної хвилі (або частоти випромінювання) називається спектром поглинання речовини, який є специфічною характеристикою даної речовини.

Залежно від  агрегатного стану речовини спектри  розділяються на три групи: лінійчатий (для газів при низькому тиску, що складається з одноатомних  молекул); смугастий (для газів, пари, рідин, що складаються з багатоатомних молекул) і суцільний (для розжарених твердих і рідких тіл). Якщо поглинач—тверде тіло (стекло, пластмаси і інше), області поглинання широкі і межа смуги поглинання, як правило, не різка. Для молекулярних рідин, розчинів і пари області поглинання спостерігаються у вигляді смуг, які несуть інформацію про будову досліджуваних речовин і їх концентрації. Зміни спектру дозволяють зробити висновки про процеси, що відбуваються в речовині. При дослідженні лікарських органічних сполук важливе місце займає молекулярний спектральний аналіз (МСА). У його основі лежить якісне і кількісне порівняння спектру досліджуваного зразка із спектрами інших речовин. У спектрофотометричних методах застосовуються спектрофотометри — прилади, що дозволяють проводити аналіз як забарвлених, так і безбарвних з'єднань по виборчому поглинанню монохроматичного випромінювання у видимій, ультрафіолетовій (УФ) і інфрачервоній (ГИК) областях спектру.

 Для збудження електронних переходів молекул звичайно необхідне видиме або ультрафіолетове випромінювання. Низькоенергетичне інфрачервоне випромінювання порушує коливальні переходи в атомній підсистемі молекул, тоді як чисті обертальні переходи при обертанні молекули як цілого спостерігаються в ще менш енергетичних мікрохвильових і радіочастотних діапазонах.

 Таким чином, природа смуг поглинання (молекулярних спектрів) в УФ і видимої частинах спектру пов'язана з різними електронними переходами в поглинаючих молекулах і іонах (електронна спектроскопія). У ГИК області вона пов'язана з коливальними переходами в молекулах (коливальна спектроскопія). У МСА розрізняють також спектри комбінаційного розсіяння світла (КРС) і спектри флуоресценції.