Физические методы исследования биологических объектов

 Використовувана в даний час апаратура дозволяє вимірювати УФ-СПЕКТРИ в області від 190 до 380 нм, видимі—від 380 до 780 нм, ІК-СПЕКТРИ — від 780 нм до 1 мм.

 Кількісний МСА, пов'язаний з вимірюванням поглинання електромагнітного випромінювання, заснований на законі Бугера—Ламберта—Бера, що встановлює зв'язок між інтенсивностямі падаючого/0 і проникаючому/ через речовину світла залежно від товщини / поглинаючого шару і концентрації речовини.

 Молярний показник поглинання е (е' = 0,43е) є специфічною фізичною константою для кожної речовини і може бути використаний в цілях його ідентифікації. Його визначення дозволяє встановити вміст даної речовини в розчинах невідомої концентрації на основі вимірювання оптичної густини.

 Закон Бугера—Ламберта—Бера строго не виконується, якщо падаюче випромінювання немонохроматично (колориметричний і фотоколориметричний аналіз). В даному випадку цей закон застосовний з великим або меншим наближенням залежно від ступеня постійності оптичної густини в досліджуваному інтервалі довжин хвиль. Відхилення від закону Бугера—Ламберта—Бера спостерігаються також в наступних випадках:

1) якщо різні  форми поглинаючих частинок знаходяться в рівновазі, як, наприклад, у разі таутометрії або кислотно-основної рівноваги;

2) якщо системи  мають явно виражену тенденцію  до асоціації молекул розчиненої  речовини між собою, або між  молекулами розчиненої речовини  і розчинника.

 Взаємодія розчиненої речовини з розчинником широко поширена, і його сліди можна спостерігати в кожному спектрі.  
 

Отримання електронних спектрів і принципи їх аналізу.

  Основними частинами звичного спектрофотометра є: джерело світла, монохроматор і детектор минулого через речовину випромінювання. Робочий діапазон більшості спектрофотометрів складає 190 .750 нм. Джерелом випромінювання з Х- 190 .450 нм служить дейтерієва розрядна лампа, випромінювання якої безперервне в цьому діапазоні, а решту частини діапазону забезпечує лампа розжарювання. Для розкладання джерела випромінювання в спектр використовується диспергуючий елемент. Із спектру, що виходить, за допомогою щілини вибирається вузький інтервал довжин хвиль. Таке випромінювання можна розглядати як монохроматичне.

Монохроматичне  світло розщеплюють на два промені, один з яких проходить через осередок (кювету), що містить розчин речовини, що вивчається, а інший — через  такий же осередок, що має тільки розчинник. Потім минуле через обидва осередки проміння автоматично порівнюється, і результати порівняння реєструються при безперервній зміні довжини хвилі. У сучасних приладах інтенсивності випромінювання і , що пройшли через розчин і розчинник, вимірюються фотоелектрично. Крива, виражаюча залежність інтенсивності поглинання від довжини хвилі або частоти, називається спектральною кривою поглинання, або спектром поглинання. Вимірювальна шкала спектрофотометра проградуйована у відсотках пропускання Т,

а шкала довжин хвиль або хвильових чисел (до — \1Х)— в нанометрах або в см 1 відповідно.

 Звичайно електронний спектр зображається у вигляді графіка залежності D від X. Якщо відома молярна концентрація, то по такому спектру нескладно розрахувати молярний коефіцієнт поглинання е. Часто після цього будують графік залежності е або lg e від довжини хвилі X. Графік логарифмічної залежності представляє особливий інтерес в тих випадках, коли в одному спектрі є смуги різної інтенсивності. Електронні спектри поглинання звичайно складаються з декількох широких смуг і не мають вузьких піків, оскільки будь-який електронний перехід супроводжується тими або іншими змінами в обертальних або коливальних станах молекул. Найважливішою характеристикою смуг є довжина хвилі, при якій спостерігається максимум поглинання. Іноді, якщо сусідні смуги частково перекриваються, указується мінімум поглинання.

    Розглянемо використовування електронних спектрів поглинання для отримання даних про структуру молекул. Характер електронних спектрів молекул органічних речовин обумовлений трьома основними структурними елементами: зв'язуючими а- і л-орбіталямі, розпушуючими а- і л-орбіталямі (збуджений стан) і незв'язуючими орбіталямі неподілених пар електронів гетероатомів, або і-орбіталямі, які за визначенням не мають відповідного збудженого стану. На малюнку схематично представлені відносні енергії цих електронних станів з можливими енергетичними переходами при збудженні молекули квантами випромінювання в УФ- діапазоні. З'єднання, що містять тільки одинарні зв'язки, поглинають у області довжин хвиль менше 190 нм; прості з'єднання з кратними зв'язками — нижче 240 нм; прості з'єднання з вільними електронними парами—нижче 260 нм. Поглинання кратних зв'язків, неподілених пар і різних їх комбінацій визначають всі електронні спектри органічних сполук в ближній УФ-області.  

РИС. Спектри поглинання трьох ароматичних амінокислот. Щоб зобразити всi три криві на одному малюнку, використана логарифмічна шкала. 
 
 
 
 
 
 
 

Основні принципи спектроскопії в області електронних  переходів молекул витікають з квантовомеханічеського розгляду. Ті ж принципи без істотних змін застосовні до всіх видів спектроскопії. Найбільш інформативними параметрами спектрів є довжина хвилі переходу, яка відображає різницю енергій станів, що беруть участь в переході, і інтенсивність, яка пропорційна квадрату індукованого світлом дипольного моменту (моменту переходу).

Поглинання білків в дальній УФ-областi визначається пептидними

хромофорами, а в ближній — головним чином бічними групами ароматичних амінокислот. У нуклеїнових кислотах основний внесок до поглинання вносять основи. 

б)Інфрачервона(коливальна) спектрометрія

 Взагалі кажучи, інфрачервоні  спектри повинні містити таку ж інформацію, що і спектри у видимій і УФ-областях, проте насправді дані по ІЧ-спектрам виявляються набагато менш цінними. Причин тому декілька. По-перше, для коливальних переходів характерна значно менша інтенсивність, чим для електронних. Наприклад, коефіцієнт екстінкциї основ нуклеїнових кислот в ІЧ-областi складає — 103, тоді як для УФ-спектрiв ця величина на порядок більше. Отже, при реєстрації ІЧ-спектру зразок повинен бути набагато більш концентрованим. По-друге, багато смуг ІЧ-спектрiв білків і нуклеїнових кислот розташовано в тій спектральній області, де спостерігається сильне поглинання води_{. Нарешті, відповідні прилади, зокрема інфрачервоні детектори, часто виявляються менш чутливими, чим прилади, що використовуються при спектроскопічних досл}ідженнях у видимій і УФ-областях, що створює додаткові труднощі при отриманні точних кількісних даних.

Коливальні смуги  поглинання зазвичай породжуються переходами, які можна досить точно віднести до певних хімічних зв'язків. Так, говорять про смуги, пов'язані з розтягуванням зв'язків С=0, С-Н або амідной групи і т.д. Це служить зручним способом опису, який є вельми точним для невеликих молекул, але, взагалі кажучи, є значне спрощення.

Коливання різних пар або груп атомів в молекулах  зв'язані між собою, і коливання молекули в цілому, які необхідно розглядати при описі спектру, в принципі охоплюють всі атоми. Ці коливання потрібно привести до нормального вигляду, який відповідає стаціонарним станам гамільтоніана, що описує коливання молекули. Будь-яке конкретне коливання може бути представлене у вигляді лінійної комбінації нормальних коливань. Таким чином, у багатьох випадках не можна дати просту фізичну інтерпретацію виникнення тієї або іншої коливальної смуги поглинання. Часто (але не завжди) дане нормальне коливання буває пов'язано з помітним зсувом лише двох зв'язаних атомів, решту атомів можна вважати нерухомими. У такому разі опис спектрального переходу з використанням уявлень про вигин або розтягування конкретного зв'язку може виявитися достатньо точним.

  Коливальна спектроскопія — розділ молекулярної спектроскопиії, вивчаючий спектри поглинання і відбивання, зумовлені квантовими переходами між коливальними рівнями енергії молекул. Діапазон частот коливальних переходів — від 3·10¹¹ до 10¹⁴ Гц (хвильове число від 10 до приблизно 40000 см^-1).

Коливальні спектри можуть бути отриманш або в результаті безпосереднього поглинання речовиною інфрачерного випромінювання, або при поглинанні видимого і ультрафіолетового випромінювання, коли частина поглинутої енергії використовується для збудження молекул, а більша частина реемітірується речовиною. Відповідно, коливальна спектроскопія поділяється на інфрачервону спектроскопію і спектроскопію комбінативного розсіяння (раманівську).

  Інфрачервона спетроскопія, ІЧ-спектроскопія, (рос. инфракрасная спектроскопия, ИК-спектроскопия, англ. infra-red spectroscopy; нім. Infrarot-Spektroskopie f) – різновид молекулярної оптичної спектроскопії, оснований на взаємодії речовини з електромагнітним випромінюванням в ІЧ діапазоні: між червоним краєм видимого спектра (хвильове число 14000 см^-1) і початком короткохвильового радіодіапазону (20 см^-1).

   ІЧ-спектри виникають при поглинанні ІЧ-випромінення на частотах, що співпадають з деякими власними коливальними і обертальними частотами молекул або з частотами коливань кристалічної ґратки. ІЧ-спектри отримують за допомогою спектрометрів різних типів, робочий діапазон яких знаходиться в межах так званої фундаментальної ІЧ-області (300 см^-1 - 4000 см^-1).

  Найпоширенішим при приготуванні зразків для інфрачервоної спектроскопії є метод, оснований на приготуванні таблеток з KBr.На основі ІЧ-спектрів можна проводити якісний та кількісний аналіз речовини.

 Інфрачервона спектроскопія дозволяє отримувати спектри речовини у всіх її агрегатних станах. Інфрачервоні (ІЧ) спектри дають характеристику речовин. Наявність в ІЧ-спектрах тих чи інших полос поглинання дозволяє розшифровувати структуру речовини.

 ІЧ-спектроскопія відбивання використовується при дослідженні твердих тіл, особливо монокристалів. Для сильнопоглинаючих зразків і поверхневих сполук розроблений так званий метод нарушеного повного внутрішнього відбиття. Успішно використовується ІЧ-спектроскопія для вивчення флотаційних реагентів, міжфазної зони “адгезив-субстрат”, ідентифікації і кількісних вимірювань промислових забруднень, аналізу в польових умовах, вивчення реакцій в атмосфері та ін.

Інфрачервоні спектри діляться по діапазону: ближній( від 4500 см^-1 до 40000 см^-1), середній (400 - 4500 см^-1) і дальній (10 - 400 см^-1).

  В хімії  ІЧ-спектроскопія використовується для отримання інформації про структуру молекули, для кількісного аналізу, для якісного аналізу; при цьому спектри зазвичай інтерпретируються на основі використання енмпіричних закономірностей.

Частоти коливальних спектрів використовуються також для розрахунку силових полей молекул, тобто для визначення різноманітного типу сил взаємодії атомів у молекулі. Так звані силові постійні для великого числа груп атомів володіють властивістю виношуваності, тобто постійністю в рядах подібних за будовою молекул.

  КР-спектроскопія  базується на непружному розсіянні  світла(розсіяння Рамана) в інфрачервоній  області зі зміною частоти.  Причиною зміни частоти є додавання до електромагнітної енергії світлової хвилі коливальної енергії молекули

  На відміну  від  ІЧ-спектроскопія,в КР-спектроскопії можна використовувати як розчинник воду. Використовується для доведення цвітеріонної будови амінокислот, виявлення моно-, ди-, та три фосфатів азотистих основ, що входять до складу нуклеїнових кислот, та визначення кількості  спарених і неспарених основ в них, кількості S-S зв’язків в біках тощо.

  Інфрачервоні (коливальні) спектри використовуються  для ідентифікації лікарських препаратів. ІЧ-спектри більшості органічних сполук на відміну від УФ-спектрів характеризуються наявністю великою кількістю ліків поглинання. Метод ІЧ-спектроскопії дає можливість одержати найбільш повну інформацію про будову і склад аналізуємої речовини, яка дозволяє ідентифікувати дуже близькі по структурі сполуки. Метод інфрачервоної спектроскопії прийнятий для ідентифікації органічних лікарських речовин з полі функціональними групами шляхом порівняння із спектрами стандартних зразків, які зняті в однакових умовах.