Физические методы исследования биологических объектов

                    
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Реферат

на тему:

«Фізичні  методи                                              дослідження біологічних                                        об’єктів» 
 
 
 

                                                                             
 
 
 
 

                                                                    
 

                                                        Київ 2008

                                        Зміст :

  1. Вступ…………………………………………………………………3

  2. Загальна характеристика методів аналізу…………………………4

  3. Спектральний аналіз……………………………………………….10

       а) ультрафіолетова та видима спектрометрія……………………14

       б) інфрачервона(коливальна) спектрометрія…………………….22

       в) ядерний магнітний резонанс…………………………………...27

       г) електронний парамагнітний резонанс…………………………37

      е) флуорисцентна спектроскопiя …………………………………42

      ж) спектроскопiя комбiнативного розсiяння………………………44

  4. Рефрактометрія……………………………………………………..47

  5. Висновки...........................................................................................54

  6. Список лiтератури………………………………………………….55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1.Вступ

  В пізнанні природи життєвих процесів серед таких фундаментальних біологічних дисциплін ,як цитологія ,генетика ,біохімія ,фізіологія ,важливе місце займає також біофізика. Біофізика - наука ,яка вивчає фізичні механізми та фізико-хімічні процеси ,що лежать в основі життє- діяльності біологічних об’єктів. Іншими словами ,це фізика живих систем на різноманітних рівнях їх організації-молекулярному, мембранному, клітинному, органному та популяційному.

Біологічні форми  руху матерії є складними, але  вони включають в себе більш прості фізичні та хімічні форми, що виявляються в нових якісних сполученнях. Виходячи з цих матеріалістичних позицій, фізика з її методами

Є дуже важливим ключем до рішення багатьох проблем  сучасної біології.

Разом з цим, правильне використання законів  фізики можливе лише при наявності  визначених меж системи, для якої можливе проводити досліди та розрахунки.

Сучасна біофізика  використовує найновіші методи досліджень і строгі кількісні докази кожного  положення. В ній широко використовуються такі точні та чутливі біофізичні методи  дослідження, як електрофорез, ультра-

центрифугування, калориметрія, рентгеноструктурний аналіз, нейроноскопія,

спектрометрія, електронна  мікроскопія і т.д. Вони поєднуються з математичним моделюванням досліджуваних систем з допомогою ЕОМ. Саме тому біофізика  на ряду з іншими науками стає теоретичною  основою сучасної біології. Але разом з цим, вона вирішує і важливі практичні задачі сільського  господарства і медицини, багато біофізичних методів широко використовуються в клініці для діагностики захворювань(векторна електро-

кардіографія , ЯМР-томографія і т.д).

  
 
 
 

2.Загальна характеристика методів дослідження 

  Визначення структури молекул є грандіозним завданням, і жоден з відомих в даний час методів не може справитися з нею наодинці. У ряді випадків кінцевою метою є визначення координат всіх атомів, що входять до складу білка або нуклеїнової кислоти. У молекулі, маса якої складає 30000 дальтон, міститься приблизно 4000 атомів. Положення кожного з цих N атомів в просторі визначається трьома координатами. Оскільки в даному випадку не має значення, які орієнтація або положення в просторі всієї молекули, шість координат є довільними. Щоб визначити структуру молекули, потрібно зміряти 3N — 6 параметрів. Крім того, потрібно встановити, що за атом знаходиться у відповідній позиції усередині молекули, тобто додається ще N невідомих.

Для того, щоб  повністю визначити структуру звичайного білка мол. масою ~ 30000 або нуклеїнової  кислоти з такий же мол. масою, потрібно було б знайти 16000 невідомих. Якщо виключити з розгляду атоми  водню, то це число скорочується наполовину. Але навіть і в цьому випадку вимоги продовжують залишатися надмірними. Жоден з відомих в даний час методів не може надати таку кількість докладної інформації про одну і ту ж систему. За допомогою деяких методів з числа найбільш поширених ми отримуємо фактично лише один або два параметри, які можуть бути корисні для характеристики макромолекулярної системи.

На щастя, на практиці ситуація рідко виглядає настільки  похмурою, як це було тільки що описано. Первинна структура досліджуваної  макромолекули зазвичай буває вже відома. В цьому випадку залишається визначити всі довжини зв'язків і кути між сусідніми зв'язками, а також (для всіх атомів, окрім водню) кут внутрішнього обертання; для структури з 4000 атомів потрібно визначити, таким чином, близько 10000 параметрів. Часто буває відома точна хімічна структура (тобто довжини зв'язків і кути між зв'язками кожного залишку, що входить до складу досліджуваного біополімеру. У таких випадках залишаеться визначити лише взаємне розташування цих залишків, тобто для вирішення завдання потрібно визначити близько 2000 параметрів. Таким чином, завдання, що стоїть перед фізікохиміком, набуває вже цілком розумних меж (хоча вона і не завжди здійснима).

Для білків і  нуклеїнових кислот можна ще більш  спростити це завдання. Щоб описати  відносне розташування двох сусідніх залишків в поліпептидной ланцюзі, досить задати два кути, а для опису орієнтації кожного бічного ланцюга, ймовірно, буде потрібно в середньому ще два параметри. У білці з мол. масою 30000 міститься 300 амінокислотних залишків, тобто необхідно визначити близько 1200 параметрів. Для нуклеїнової кислоти тієї ж маси буде потрібно всього 800 параметрів.

Щоб визначити  будову, хімічні та біохімічні властивості властивості  речовини та встановлення взаємозв’язку між будовою сполуки та її властивостями , необхідно одержати ці речовини в чистому вигляді  та ідентифікувати їх за використанням методів розділення речовин.

В залежності від  мети дослідження (виявлення властивостей, дослідження структури, якісний  чи кількісний аналіз, виділення речовини в чистому вигляді , тощо) застосовують різні методи виділення та очищення. Так, при вирішенні аналітичних завдань застосовують різні методи розділення з високою точністю визначення ( тонкошаровий електрофорез ,електрофорез на ацетаті целюлози ,диск-електрофорез) та невелику кількість речовини; у іншому випадку (препаративне розділення) використовують методи, (осадження, діаліз, хроматографія, адсорбція), які дозволяють якісно розділити великі кількості речовин. Будь-які способи очищення завжди супроводжуються втратою вихідного матеріалу, тому кількість стадій очищення повинна бути  мінімальною. Методи, що застосовуються для розділення , мають базуватися на усіх можливих відмінностях у властивостях молекул. Тобто, за використання декількох стадій очищення , методи, що застосовуються , повинні базуватися на різнорідних властивостях речовин, що добуваються , тому що застосування різних методів ,що використовують одні і ті ж властивості ,не дає значного покращення очищення сполуки.

  При виборі  методів очищення необхідно брати до уваги мету розділення      ( аналітична чи препаративна); фізичні властивості досліджуваної речовини   (заряд, масу, розчинність, леткість тощо); враховувати стабільність речовин .      

ІНСТРУМЕНТАЛЬНІ МЕТОДИ  АНАЛІЗУ

 Інструментальні або фізико- хімічні методи аналізу засновані на вимірюванні за допомогою приладів певних фізичних властивостей системи, які є функцією кількості компоненту, який визначають, в пробі, що аналізують.

    Інструментальні  методи аналізу мають ряд переваг у порівнянні з класичними методами : значно вищу чутливість, селективність, експресність, обєктивність, можливість автоматизації і компютеризацій процесу аналізу.

    Інструментальні  методи аналізу можна поділити  на декілька груп:

- оптичні методи

- електрохімічні методи

- хроматографічні методи

ОПТИЧНІ МЕТОДИ АНАЛІЗУ

До оптичного  діапазону відносяться електромагнітні  хвилі з довжиною від 100 до 10000 нм. Його розділяють на три області :

ультрафіолетову (УФ) 100-380 нм;

видиму 380-760 нм;

інфрачервону (ІЧ) 760- 10000 нм.

    В залежності від характеру взаємодії речовини з електромагнітним випромінюванням оптичні методи розділяють на :

абсорбційні (засновані  на вимірюванні поглинання речовиною  світлового випромінювання). До них  відносять колориметрію, фотоколориметрію, спектрофотометрію, атомно-адсорбційні методи;

емісійні ( засновані  на вимірюванні інтенсивності світла, випромінюваного речовиною). До них  відносяться флюориметрія, емісійний  спектральний аналіз та полумяна фотоменрія.

  Методи, повязані із взаємодією світлового випромінювання з суспензіями, поділяють на:

турбідиметрію ( заснована на вимірюванні інтенсивності  світла, яке поглинається незабарвленою  суспензією) ;

нефелометрію ( заснована на вимірюванні інтенсивності  світла, яке відбивається або розсіюється забарвленою або незабарвленою суспензією ).

   Методи, засновані на явищі поляризації  молекул під дією світлового  випромінювання ділять на :

- рефрактометрію( заснована на вимірюванні показника заломлення) ;

- поляриметрію (заснована на вимірюванні кута обертання плоскості      поляризації поляризованого променя світла, що пройшов через оптично активне середовище) ;

- інтерферометрію ( заснована на вимірюванні зсуву інтерференції світлових променів при проходженні їх крізь кювети з розчином речовини, розчинником та крізь коліматор)

    Оптичні  методи аналізу нерозривно повязані  з використанням сучасних приладів  різної складності, що породжує  вартість аналізу , але дає  ряд переваг у порівнянні з  класичними хімічними методами : експресність, нерушійність зразків, простоту методики, використання невеликої кількості речовини для аналізу, можливість аналізувати сполуки будь-якої природи проведення експрес  аналізу багато компонентних сумішей. Крім того вони підвищують чутливість. Точність і відтворюваність результатів кількісних визначень.

   Є ряд  методів розділення біологічних об’єктів :

   - седиментація

     а)диференційне  центрифугування,

     б)зональне швидкісне  центрифугування,

     в)аналітичне  центрифугування;

    - електрофорез,

     а)низьковольтний електрофорез,

     б)високовольтний  електрофорез,

     в)фронтальний  електрофорез,

     г)зональний  електрофорез,

     д)диск-електрофорез,

     е)ізоелектричне  фокусування,

     є)імуноелектрофорез;

   -хроматографія

    а)адсорбційна  хроматографія,

    б)хроматографія  в тонкому шарі,

    в)газорідинна  хроматографія,

    г)іонообмінна  хроматографія,

    д)гель-проникаюча  хроматографія,

    е)афінна  хроматографія;

   -діаліз

-мембранна фільтрація.

  Ці методи належать до фізико-хімічних методів дослідження.

  Для ідентифікації речовин в основному використовують фізичні методи, що

дозволяють визначати  структуру макромолекул на їх атомарному рівні; властивості макромолекул, що зумовлюють їх структуру; локалізацію  молекул в клітині; фізичні параметри та взаємозв’язок  структури та біологічної дії.