Аллергены

Классификация методов определения slgE

Методы определения  специфических IgE многообразны: в настоящее время существует не просто несколько методов, а несколько принципиально различающихся подходов к определению slgE . Выбор конкретного подхода определяется как клинической задачей и декларированными преимуществами того или иного метода, так и некоторыми специфическими ограничениями, существующими для большинства из них.

Методы определения slgE , в первую очередь, делятся на выполняемые in vivo и in vitro.

Тесты in vivo имеют долгую историю, используются для определения сенсибилизации индивидуальными аллергенами, и популярны по сей день, но, к сожалению, имеют целый ряд не только аналитических, но и серьезных клинических ограничений. Тесты для определения специфических IgE in vitro разрабатываются с 60-х годов 20-го столетия, подход к in vitro диагностике slgE несколько раз претерпевал ключевые изменения, что отражалось в понятии "новое поколение in vitro тестов для slgE ", и основными ограничениями in vitro методов до последнего времени являлись их аналитические особенности и экономические показатели. Поэтому именно эти параметры и шлифуются создателями in vitro тестов от поколения к поколению. Наиболее распространенные подходы к определению slgE.

*-только для диагностических  тест-систем третьего поколения 

**- этот показатель неодинаков  для тест-систем разных поколений.

Диагностические тест-системы  для определения sIgE третьего поколения  позволяют решить большинство свойственных тест-системам in vitro и отмеченных в  графе "недостатки" проблем.

Традиционным способом in vivo определения сенсибилизации индивидуальными антигенами по сей день являются кожные пробы. Кожная проба - физиологический тест, позволяющий обнаружить сенсибилизированные тучные клетки в коже человека. Классификация кожных проб проводится по методу введения провокационного материала в зону исследования:

-аппликационные (накожные, patch -тесты, эпикутанные);

-внутрикожные пробы; 

-прик-тест;

-скарификационные.

Перечисленные выше типы кожных проб различаются между собой  по аналитическим характеристикам  и имеют разное клинико-диагностичекое предназначение. Так, внутрикожные пробы чаще применяются для выявления сенсибилизации к аллергенам бактериального и грибкового происхождения, а также для определения степени чувствительности к аллергенам неинфекционной природы; прик-тест чаще применяют для диагостики реагинового типа аллергических реакций, например, пищевой, лекарственной, пыльцевой аллергии. Patch -тесты чаще всего используют для выявления сенсибилизации на косметические средства и металлы (стандартная Европейская панель содержит 23 аллергена-никель, хром, кобальт и т.д.). В России же, благодаря невысокой стоимости и доступности определения, до настоящего времени наиболее распространенным является скарификационный тест.

Основным преимуществом  кожной пробы является наглядность  получаемых результатов для пациента, относительно невысокая стоимость определения и возможность определения факторов хронической сенсибилизации организма в состоянии ремиссии A3, так как IgE -антитела, иммобилизованые на поверхности сенсибилизированных тучных клеток способны функционировать более 10 недель.

Основным клиническим  недостатком кожной пробы является риск повторной провокации острого  приступа A3 и/или сенсибилизации de novo при неправильном выборе провокационного антигена. Кроме того, большинство тестов in vivo показывают ложно заниженные результаты, если пациент принимает антигистаминные препараты, поэтому при мониторинге эффективности лечения назначенную ранее терапию необходимо отменять как минимум за 3-5 дней до проведения теста.

С точки зрения аналитического подхода ограничением можно считать мануальное выполнение пробы и визуальную оценку результатов без наличия четких стандартов их оценки, что приводит к полной субъективности получаемых результатов. Поэтому результаты кожных проб необходимо сопоставлять с клиническими данными и данными аллергологического анамнеза.

Все без исключения методы in vitro определения, напротив, абсолютно безопасны для пациента, т.к. не требуют внесения в организм больного дополнительных количеств аллергенов. Кроме того, при определении аллерген-специфических антител in vitro  
возможно определение не только индивидуальных аллергенов, но и определение "панелей" - групп из нескольких родственных аллергенов, иммобилизованных на твердофазном носителе. Подобный подход очень удобен при обследовании больных с многофакторными A3: он в значительной мере позволяет снизить количество шагов на пути от первоначального направления на анализ до получения точной картины заболевания. С одной стороны, это экономически выгодно, поскольку означает снижение общей стоимости исследования и его продолжительности. С другой стороны, "панельное" исследование дает возможность прогнозировать риск развития аллергических реакций при контакте с новыми аллергенами, гомологичными к уже имеющимся в списке пациента.

Однако существенным ограничением применения in vitro методов до последнего времени служил тот факт, что они направлены на регистрацию аллерген-специфических lgE-антител, циркулирующих в крови. Поскольку продолжительность жизни свободных IgE не превышает нескольких дней, наибольшая достоверность результатов in vitro исследований достигается при анализе проб, отобранных в острой фазе A3.

В то же время понятно, что при многофакторном A3 приступы, возникающие в разных условиях (время  года, смена зоны проживания пациента, новые продукты в рационе), могут иметь под собой различающиеся причины. Таким образом, в течение долгого времени бытовало мнение, что in vitro методы оптимальны для выявления причин "свежего" приступа A3, тогда как in vivo определение позволяет понять масштаб и оценить наличие всех основных факторов, провоцирующих A3.

Более того, приведенная  выше таблица 7 наглядно показывает, что  основные ограничения, препятствующие широкому распространению in vitro методов в отечественной лаборатории, обусловлены их стоимостью, продолжительностью анализа и возможной недостаточностью чувствительности тест-системы при обследовании пациентов с ожидаемыми низкими уровнями IgE - в стадии ремиссии A3 или же в самом начале аллергического заболевания. История развития in vitro диагностики slgE показывает, что с подобными же ограничениями сталкивались производители и пользователи тест-систем первого и второго поколений. За время своего существования технология исследования аллерген-специфических IgE претерпевала не только уточнение аналитических характеристик, но и неоднакратную принципиальную смену аналитического принципа метода.

В самых ранних тестах использовались частицы микрокристаллической целлюлозы с иммобилизованными  на поверхности аллергенами, на смену  ему пришел радиоиммунный метод  исследования (РИА, mRAST ), Производители РИА-методов для определения аллерген-специфических антител также совершенствовали свое детище на протяжении всего периода существования метода. Именно поэтому результаты, полученные РИА- методом, по своей специфичности и клинической адекватности до сих пор считаются референсными.

К сожалению, для РИА-систем характерны все отмеченные в таблице 7 недостатки: метод трудоемок, продолжителен (от 12 до 24 часов), и достаточно дорог. Поиск новых, более быстрых и  менее дорогих путей in vitro диагностики slgE привел к появлению целого ряда иммуноферментных методов с колориметрическим, флюориметрическим и хемилюминесцентным способом регистрации результатов. Продолжительность теста сократилась до нескольких часов, стоимость также значительно уменьшилась. Однако большинство указанных тест-систем, названных “вторым поколением ” ИФА, не давало результатов, сопоставимых по специфичности и клинической достоверности с РИА- методом. Более того, список доступных этим методам аллергенов был невелик, а чувствительность, специфичность и главное - клиническая достоверность - были гораздо ниже, чем у референс-методики.

Еще одним недостатком  тест-систем второго поколения являлась невозможность унифицировать результаты исследования, полученные на разных тест-системах, и разработать единую систему стандартизации и контроля результатов. Изначально система классификации результатов была условной: для сывороток пациентов с диагностированной аллергией было сформировано пять групп (классы от 0 до IV ) - по мере возрастания титра lgE -антител и клинических проявлений. Затем для ИФА методов была принята методика определения концентрации sfgE в кЕ/мл по калибровочной кривой, построенной на результатах определения общего IgE (1 кЕ/мл = 0,001 мЕ/мл).

К сожалению, несмотря на удобство такого подхода, разнообразие аллергенов и, следовательно, модификаций антител к ним не позволяет с уверенностью говорить о том, что по все формы slgE подчиняются законам этой калибровочной кривой. Поэтому большинство производителей тестов для определения аллергенспецифических антител в дополнение к общей калибровочной кривой приводят первоначальные референсные значения slgE к разным аллергенам. В ряде случаев эта задача делегируется самой лаборатории, выполняющей исследования.

Поэтому сравнение разных методов in vitro определения до сих пор проводится не в количественном формате, а в квалификационной оценке сопоставимости результатов. На настоящий момент при сравнении двух открытых ИФА-систем с любым типом считывания сопоставимыми считаются методы, показывающие не менее 85% совпадающих результатов. Кроме того, при калибровке ИФА-тестов второго поколения не была достигнута возможность получения калибратора с реальным значением 0 кЕ/мл. Поэтому в определение "отрицательных" входили все результаты ниже определенного порогового уровня.  
Пороговый уровень определялся минимальным значением калибратора и в разных тест-системах варьировал от 0,20 до 0,30 кЕ/л г а более малые значения при необходимости рассчитывались методом экстраполяции.

Это создавало дополнительную диагностическую проблему - достаточно трудно было оценить зону разделения нормальных и патологических значений. Однозначной же оценке - "отсутствие аллерген-специфичеких антител - норма, присутствие - патология 1 ", мешал тот факт, что достоверно оценить методом экстраполяции реальное различие между 0 и 0,20 кЕ/л было практически невозможно. Поэтому результаты, полученные на разных тест-системах, могли в одном случае соответствовать норме, а в другом - патологии. По той же причине невозможным было и решение клинической задачи диагностики сверхнизких значений у больных с малой степенью сенсибилизации или в стадии ремиссии.  
Следует сказать, что ограничения в области точного определения сверхнизких значений свойственны и референсному РИА-методу. Именно этим и определяется прежняя популярность кожных проб, в частности - для больных в стадии ремиссии вследствие успешной терапии.

Но даже использование  кожных проб не охватывает целую группу больных - пациентов с дебютом  заболевания и низким уровнем сенсибилизации тучных клеток.

Клинически эта группа является одной из самых важных:

во-первых, на ранних этапах A3 количество аллергенов, провоцирующих  реакцию, чаще всего незначительно, а следовательно легче поддается  и диагностике, и контролю;

во-вторых, у своевременно выявленных больных при адекватном лечении значительно снижается риск развития тяжелых патологий, таких как бронхиальная астма, атопические дерматиты и др,

в-третьих, недостаточное  накопление иммобилизованных IgE может  не позволить выявить причину аллергической реакции методом in vivo , тогда как неоднократное повторение кожных проб с разными вариантами аллергена именно у таких больных создает высокий риск сенсибилизации de novo и присоединения к патологическому процессу новых факторов его развития.

Именно этим целям  и послужила разработка последнего - третьего поколения тестов для  лабораторной in vitro диагностики аллерген специфических IgE . В основе метода лежит полностью автоматизированное иммуноферментное определение аллерген-специфических IgE с хемилюминесцентным способом регистрации результатов.

Метод основан на пробирочной  технологии, т.е. в отличие от планшетных методов позволяет исследовать  индивидуальные образцы пациента непосредственно  после взятия образца, для определения короткоживущих циркулирующих slgE этот фактор также является немаловажным. Одним из неоспоримых преимуществ этой модификации метода является полная автоматизация определения, позволяющая сократить время анализа в 2-4 раза в сравнении с ИФА второго поколения, а также возможность использования реальных калибраторов, рекомендованных ВОЗ.