Клонирование животных

                      Клонирование  овец.

Уиландсин  ещё  в  1986  году  показал, что   эмбрионы  овец  на  16-клетоной  стадии  развития  сохраняют  свою  тотипотентность. Реконструированные  яйцеклетки, содержащие  ядра  бластомеров  16-клетоных  зародышей, развивались  нормально  до  стадии  бластулы  в  перевязанном  яйцеводе  овцы (в  агаровом  цилиндре), а  после  освобождения  от  агара,  пересаживали  в  матку  овцы – второго  реципиента – ещё  на  60  дней. В  другом  случае  донорами  служили  ядра  8-клетоных  зародышей  и  были  получены  три живых ягнёнка, фенотип которых соответствовал  породе  овцы-донора.

В  1989  году  Смит  и  Уилмут  трансплантировали  ядра  клеток  16-клетосного  эмбриона  и  ранней  бластулы  в  лишённые  ядра  неоплодотворенной  яйцеклетки  овец. В  первом  случае  было  получено  два живых ягнёнка, фенотип которых соответствовал  породе  овец – доноров ядер.Во  втором  случае  один  полностью сформировавшийся  ягнёнок погиб во  время родов. Его фенотип также соответствовал  породе-донору. Авторы  считали, что  в  ходе  дифференцировки  эмбрионных  клеток  происходит  инактивация  некоторых  важных  для  развития  генов  и  в  результате  ядра  бластулы  уже  не  могут  репрограммироваться  в  цитоплазме  яйцеклетки  и  обеспечить  нормальное  развитие  реконструированного  зародыша. Поэтому, по  мнению  авторов, в  качестве  доноров  ядер  лучше  использовать  16-клеточные  эмбрионы  или  культивированные  in  vitro  линии эмбриональных клеток, ядра  которых обладают  тотипотентностью.

Позднее, в  1993-95  гг., группа  исследователей  под  руководством  Уилмута  получила  клон  овец – пять  идентичных  животных, донорами  ядер  которых  была  культура  эмбриональных   клеток. Клеточную  культуру  получали  следующим  образом: выделяли  микрохирургическим  путём  эмбриональный  диск  из  9-дневного  овечьего  эмбриона (бластулы)  и  культивировали  клетки  in  vitro  в течение многих  пассажей (по  крайней мере,  до  25). Сначала клеточная культура  напоминала  культуру  стволовых дифференцированных  эмбриональных  клеток, но  вскоре, после  2-3  пассажей, клетки  становились  уплотнёнными  и  морфологически  сходными  с  эпителиальными. Эта  линия  клеток  из  9-дневного  зародыша  овцы  была  обозначена  как  TNT4.

Чтобы  донорское  ядро  и реципиентная  цитоплазма  находилась  на  сходных стадиях клеточного  цикла, останавливали деление культивируемых  клеток  TNT4  на  определённой  стадии  (GO)  и ядра  этих  клеток  пересаживали  в энуклеированные яйцеклетки  (соответственно  на  стадии  метафазы  II). Реконструированные  эмбрионы  заключали в агар   и трансплантировали в перевязанные  яйцеводы  овец. Через шесть дней  эмбрионы  вымывали  из  яйцеводов промежуточных реципиентов и исследовали под микроскопом. Отбирали  те, которые  достигали  стадии  морулы  и  бластулы  и  пересаживали  их  в  матку  овцы – окончательного  реципиента, где  развитие  продолжалось  до  рождения. Родилось  пять  ягнят (самок), из  них  две  погибли  вскоре  после  рождения, третья  в возрасте  десяти дней, а две оставшихся  нормально развивались и достигли  8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята  были  сходны  с породой овец, от  которой получали  исходную  линию клеток  TNT4. Это подтвердил  и генетический  анализ.

Эта  работа, особенно  в  части  культуры  эмбриональных  клеток, - значительное  достижение  в  клонировании  млекопитающих, хотя  она  и  не  вызвала  особого  интереса, как  статья  того  же  Уилмута  с  соавторами, опубликованная  в  1997  году, где  сообщалось, что  в  результате  использования  донорского  ядра  клетки  молочной  железы  овцы  было  получено  клональное  животное – овца  по  кличке  Долли. Последняя  работа  методически  во  многом  повторяла  предыдущие  исследования  1996 года, но  в ней учёные  использовали  не  только  эмбриональные, но  ещё и фибробластоподобные клетки  (фибропласты – клетки  соединительной  ткани)  плода и клетки  молочной  железы взрослой  овцы. Клетки  молочной  железы  получали  от  6-летней овцы породы   Финн  Дорсет, находящейся на  последнем триместре беременности. Все три типа  клеточных культур имели одинаковое  число хромосом – 54, как обычно  у овец. Эмбриональные клетки  использовали  в качестве  доноров ядер  на  7-9  пассажах  культивирования, фибробластоподобные  клетки  плода  на  4-6  пассажах  и  клетки  молочной  железы  на  3-6  пассажах. Деление  клеток  всех  трёх  типов  оставливали  на  стадии GO  и ядра  клеток  пересаживали  в энуклеированные ооциты  (яйцеклетки)  на  стадии  метафазы  II. Большинство реконструированных  эмбрионов сначала культивировали  в перевязанном  яйцеводе  овцы, но  некоторые эмбрионы  культивировали   in  vitro  в химически определённой  среде. Коэффициент выхода  морул и  бластул при культивировании in  vitro  в одной серии опытов  был даже  вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе  (поэтому видимо  нет строгой необходимости в промежуточном реципиенте   и можно обойтись  культивированием  in  vitro).

Выход морул  и  бластул  в  серии  опытов  с  культурой  клеток  молочной  железы, был  примерно  втрое  меньше, чем  в  двух  других  сериях, когда  в  качестве  доноров  ядер  использовали  фибропластов  плода  или  эмбриональных  клеток. Число  живых  ягнят  в  сравнении  с  числом  пересаженных  в  матку  окончательного  реципиента    морул  или  бластул  было  также  в  два  раза  ниже. В  серии  опытов  с  клетками  молочной  железы  и  277  реконструированных  яйцеклеток   был  получен  только  один  живой  ягнёнок, что  говорит  об  очень  низкой  результативности  такого  рода  экспериментов   (0,36%). Анализ  генетических  маркеров  всех  семи  родившихся  в  трёх  сериях  экспериментов  живых  ягнят  показал, что  клетки  молочной  железы  были  донорами  ядер  для  одного, фибропласты    плода – для  двух  и  эмбриональные  клетки  четырёх  ягнят.. Овца  Долли  развилась  из  реконструированной  яйцеклетки, донором  ядра  которой  была  культивируемая  клетка  молочной  железы  овцы  породы  Финн  Дорсет. Долли  фенотипически  не  отличается  от  овец  этой  породы, но  сильно  отличается  от  овцы-реципиента  породы  шотландская  черномордая. Анализ  генетических  маркеров  подтвердил  этот  результат.

Успех  авторов  этой  работы,  прежде  всего,  связан  с  использованием  длительных  клеточных  культур, так  как  после  многих  пассажей  в  культуре  клеток  могли  быть  отобраны  малодифференцированные  стволовые  клетки, которые  вероятно  и  были  использованы  как  доноры  ядер. Большое  значение  имел  также тот факт, что авторы,  учитывая  результат своих прошлых работ, синхронизировали  стадии  клеточного цикла яйцеклеток  реципиента  и яйцеклеток  донора.

Своей  работой  Уилмут  с  коллегами  продемонстрировали, что  ядра  клеток  молочной  железы  взрослой  овцы  могут  быть  при  определённых  условиях  репрограммированы  цитоплазмой  ооцита  и  дать  развитие  новому  организму. Полученные  данные  заставили  по-новому  посмотреть  на  процесс  клеточной  дифференцировки. Этот  процесс, как  оказалось, не  носит  необратимый  характер. Совершенно  ясно, что  цитоплазматические  факторы  способны  инициировать  развитие  нового  организма  на  основе  генетического  материала  ядра  взрослой  полностью  дифференцированной  клетки. Таким  образом, биологические  часы  могут  быть  повёрнуты  вспять, и  развитие  организма  может  начаться  из  генетического  материала  взрослой  дифференцированной  клетки, что  полностью  противоречить  раннее  общепринятой  биологической  догме.

Если  результаты  последней  работы  Уилмута  и  соавторов  окончательно  подтвердятся  и  будет  повышен  коэффициент  выхода  живых  животных  при  использовании  в  качестве  доноров  ядер  клеток  взрослых  животных, то  это  может  иметь  революционное  значение  как  в  биотехнологии  животных  и  животноводстве. Клонирование  позволит  сохранить  не  только  генотип  ценных  и  выдающихся  в  производственном  отношении  животных, но  и  безгранично  размножать  их.

               Тканевое  клонирование.

Учёные  хотят  создавать  человеческие  эмбрионы  в  лабораториях  и  использовать  их  для  получения  специальных  клеток, которые  могут  применяться  в  революционных  методиках  лечения. Правда  клонирование  не  очень-то  подходит  для  названия  этой  операции, так  как  вызывает  непонимание  у  людей, что  же  на  самом  деле  происходит? Учёные  не  копируют  эмбрионы, они  берут  генетический  материал  из  клетки  тела  взрослого  человека  и  пересаживают  его  в  яйцеклетку, из  которой  удалён  генетический  материал.

При  соблюдении  определённых  условий  эта  новая  яйцеклетка  может  развиваться  в  эмбрион. Эта  та  самая  технология, которая  была  использована  для  создания  овечки  Долли.         

Почему  учёные  так  интересуются  этой  технологией? Это  даёт  возможность  получить  так  называемые  стволовые  клетки  различных  тканей, абсолютно  идентичных  клеткам  человека, у  которого  был  взят  генетический  материал. Например, учёные  могут  получить  нервную  ткань, кровь, сердечную  мышцу  и  даже  белое  и  серое  вещество  мозга.

Учёные  пытались  выделить  стволовые  клетки  определённых  тканей  на  протяжении  многих  лет, когда, наконец, это  удалось  в  1998  году. Учёные  утверждают, что  стволовые  клетки  могут  обеспечить  медиков  полностью  совместимой  трансплантационной  тканью. Первоначально  планируется  имплантировать  клетки  в  организм  для  восстановления  дефектов  тканей, вызванных  болезнью, например, восстановление  сердечной  мышцы  после  инфаркта. В  будущем  планируется  добиться  возможности  выращивать  из  стволовых  клеток  полностью  работоспособные  ткани.

Почему  клонирование  является  неотъемлемой  частью  этого? Клонирование  так  важно, потому  что  позволяет  создать  ткани  и органы  с полностью идентичным  генетическим  кодом. В настоящее время главная проблема  трансплантологии – отторжение  пересаженных  органов и тканей  из-за  иммунного конфликта. Медики  используют  для его решения мощные  иммунодепрессивные  препараты, которые  обладают  большим  количеством  побочных  эффектов. Клонирование  полностью  решает  эту  проблему – клетки  имплантанты  имеют  то  же  генотип  и   иммунная  система  признаёт  их  за  свои  родные. Это  снимает  проблему  поиска  генетически подходящих  доноров, например, при пересадки костного  мозга. Используя ДНК, взятое  из  клеток  кожи, учёные  могут создать клетки  костного  мозга.

При  помощи  тканевого  клонирования  можно  лечить  любые  болезни, вызывающие  дегеративные  изменения  тканей. Новая  нервная  ткань  может  помочь  при  болезни  Альцгеймера, новая  сердечная  ткань  при  инфаркте.

Правда  против  тканевого  клонирования  есть  много  противников. Многие  думают, что  эмбрион, даже  если  это  одна  клетка, представляет  собой  полноценную  человеческую  жизнь  и  уничтожение  его  или  опыты  над  ним  равны  действиям  над  взрослым  человеком.

                         Заключение.  

Итак, работы  по  клонированию  позвоночных  были  начаты  на  амфибиях  в  конце  40-х  начале  50-х  гг.  и  продолжаются  вот  уже  более  4-х  десятилетий. Что касается  амфибий, то,  как  было  сказано  в  соответствующем  разделе, несмотря  на  значительные  достижение, проблема  клонирования  взрослых  особей  остаётся  до  сих  пор  нерешённой.

Установлено, что  в  ходе  клеточной  дифференцировки  у  позвоночных  происходит  либо  потеря  определённых  генных  локусов  либо  их  необратимая  инактивация. Судя  по  всему, утрачивается  та  часть  генома, которая  контролирует  не  ранние, а более поздние стадии  онтогенеза, в частности метаморфоз  амфибий. Механизм  этого явления не  поддаётся пока  научному  объяснению. Но  очевидно, что для клонирования  взрослых  животных  необходимо  использовать  малодифференцируемые  делящиеся  клетки.

Ещё  5-6  лет  назад  никто  их  учёных  не  ставил  вопрос  об  использовании  в  качестве  доноров  ядер  клеток  взрослых  млекопитающих. Работы  сводились  в  основном  к  клонированию  эмбрионов  домашних  животных, и  многих  из  этих  исследований  были  не  очень  успешны. Поэтому  так  поразило  появившиеся  на  свет  в  начале  1997  года  сообщение  Уилмута, что  ему  и  его  коллективу  удалось,  используя  соматические  клетки  взрослых  животных, получит клональное  животное  овцу  по  имени Долли.

Каково  же  положение  вещей  сейчас? Есть   ли  серьёзные  основания  считать, что  реально  наступила  эра  клонирования  млекопитающих? Анализ  представленных  выше  данных  показывает, что  за  последние  десять  лет  в  результате  кропотливой  работы  многих  исследователей, действительно  сделан  прорыв  в  области  клонирования  эмбрионов  млекопитающих. Что  же  касается  взрослых  животных, то  пока  в  наличии  лишь  один  пример, хотя  Долли, без  сомнения, уже  вошла  в  историю  науки.

Но  у  этого  первого  успешного  эксперимента  есть  существенный  недостаток – очень  низкий  коэффициент  выхода  живых  особей  (0,36%)  и  если  учесть  высокий  процент  гибели  развивающихся  реконструированных  яйцеклеток  в  плодный  период  развития  (62%), который   в  десять  раз выше, чем  в  обычном  скрещивании  (6%), то  встаёт  вопрос  о  причинах  гибели  зародышей.

В  ближайшие  годы  главная  задача  исследователей, работающих  в  области  исследования  клонирования – это, по-видимому, создание  культивируемых  in  vitro  линий малодифференцированных  клеток, характеризующихся высокой скоростью деления. Ядра  именно  таких клеток  должны  обеспечить  полное  и нормальное  развитие  реконструированных  яйцеклеток, формирование  не  только  морфологических  признаков, но  и  нормальных  функциональных  характеристик  клонированного  оргинизма.

Что  же  касается  вопроса  о  клонировании  человека, то  в  обсуждении  этого  вопроса  следует  выделить  два  аспекта: методический  и  этический.

Методически   или  технически  клонирование  взрослых  млекопитающих  разработано  ещё  недостаточно, чтобы  можно  было  уже  сейчас  ставить  вопрос  о  клонировании  человека. Для  этого  необходимо  расширить  круг  исследований, включив  в  него  кроме  овец  представителей  и  других  видов  животных. Уилмут  с  сотрудниками  планируют, например, продолжить  свои  работы  на  коровах  и  свиньях. Такие  работы  необходимы, чтобы  установить, не  ограничивается  ли  возможность  клонирования  взрослых  млекопитающих  особенностями  или  спецификой  какого-либо  одного  или  нескольких  видов.