Клонирование животных

         Неудачи  экспериментов  с   мышами.

Успешные  опыты  с  амфибиями  заставили задуматься  учёных  о клонировании  млекопитающих, в частности мышей.

МакКиннелл  в  одной  из  своих  работах  отмечал, что  необходимые  для  этого  методы  уже  существуют  и  непонятно  почему  мышь  до  сих  пор  не  клонирована.

Однако  предсказания  МакКиннелла  не  сбылись, хотя  в  конце  70-х   гг.  опыты  на  мышах  действительно  начались  и  протекали  весьма  драматично. К  тому  времени  весьма  основательно  были  изучены  биология  и  генетика  ранних  этапов  развития  млекопитающих  и  в  частности  мыши  как  модельного  объекта.

Работа  методически  оказалась  довольно   трудной, прежде  всего,  потому  что  объём  яйцеклетки  у  млекопитающих  примерно  в  тысячу  раз  меньше, чем  у  амфибий. Однако  эти  трудности  были  успешно  преодолены. Экспериментаторы  научились  успешно  микрохирургическим  путём  удалять пронуклеусы  (одно  из  двух  гаплоидных  ядер  в  яйце  млекопитающих, в  период  после  проникновения  сперматозоида, но   до  слияния  женского  и  мужского  пронуклеусов  в ядро  зиготы  в процессе  оплодотворения. Мужское ядро  формируется из  ядерного  материала сперматозоида, женское из  хромосом  яйцеклетки)  из  зигот мыши  и пересаживать  в них клеточные ядра  ранних  эмбрионов. Однако  все полученные  разным  способом  зародыши  мышей развивались лишь  до  стадии  бластулы.

В  1977  году  появилось  сенсационное  сообщение  Хоппе  и  Илменсе  о  том, что  они  получили  7  взрослых  самок  мышей, пять  из  которых  имели  только  материнский, а  две  отцовский  геном. Это, якобы, зависело  от  того,  какой  пронуклеус  был  оставлен  в  яйце – женский  или  мужской, он  и  определял  особи  по  типу  гиногенеза  или  андрогенеза  (гиногенез – развитие  яйца  без  участия  сперматозоида, андрогенез – развитие  яйца, имеющие  только  отцовские  хромосомы – мужской  партеногенез). Их  успех  был  связан, по  описанию  авторов, с  тем, что,  удаляя  один  пронуклеус, они  удваивали  число  хромосом   другого, обрабатывая  яйца  специальным  веществом, затем  выращивали  полученные  диплоидные  гомозиготные  зародыши  in  vitro  до  стадии  бластулы  и пересаживали  в матку самки-реципиента  для дальнейшего развития.

Казалось, теперь  можно  будет  быстро  получить  млекопитающих  со  100%  гомозиготностью  по  всем  признакам. Это  особенно  важно  для  селекции, так  как  для  получения  сельскохозяйственных  животных, в  частности  крупного  рогатого  скота  с  закреплёнными  особо  ценными  качествами  обычными  приёмами  требуются  десятки  лет  работы.

Однако  данные  Хоппе  и  Илменси  подтвердить  не  удалось, хотя  многие  пытались  это  сделать. Оказалось, что  полученные  любым  способом  диплоидные  андрогенетические  и  гиногенетические  зародыши  мышей  погибают,  а  тех  же  стадиях, что  и  диплоидные  партеногенетические  (развивающиеся  из  неоплодотворённой  яйцеклетки)    эмбрионы.

Значительно  усовершенствовав  методы  извлечения  ядер  и  введения  их  в  клетку, МакГрат   и  Солтер  провели  свою  серию  экспериментов  и  сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве  доноров ядер  они использовали  зиготы, но  если  донорами  были  ранние  эмбрионы, то  реконструированные  яйцеклетки, как и   прежде, развивались только  до  стадии  бластулы.

Метод  МакГрата - Солтера  стал  широко  использоваться  разными  экспериментаторами. Так  Манн  и  Ловел-Банж  выделяли  пронуклеусы  яиц, активированных  к  партеногенезу, и  пересаживал  их  в  энуклеированные  зиготы  мышей. В  этих  случаях  эмбрионы  погибали  на  ранних  стадиях. Если  же, наоборот, пронуклеусы  получали  из  оплодотворённых  яиц  и  пересаживали  в  партеногенетические  и  лишённые  ядра  яйца, то   такие  зародыши  развивались  нормально  до  рождения.

Сурани  с  соавторами  установили, что если  добавить  женские пронуклеус   из  зиготы  мыши  к гаплоидному набору  хромосом  яйцеклетки, то  нормального развития  не  происходит, добавление  же  мужского  ядра  приводит  к нормальному развитию. С    другой  стороны, рекомбинация  женского  и  мужского  пронуклеусов  из  ранних  оплодотворённых  яйцеклеток  мышей  обеспечивает  нормальное  развитие, а  комбинация  2-х  мужских  или  2-х  женских  пронуклеусов  останавливает развитие  эмбриона.

Эти  опыты  показали, что  для  нормального  развития  млекопитающих  требуется  два  набора  хромосом – отцовский  и  материнский. Поэтому  ни  у  одного  из  известного  вида  млекопитающих  не  описан  партеногенез. Поэтому  же  работы  Хоппе  и  Илменсе  не  удалось  повторить.

Однако  такие  исследование  ещё  дважды  будоражили  научное  сообщество. В  1982  году  пересадили  ядра  клеток  партеногенетических  бластул  мышей  в   энуклеированные  зиготы. Некоторые  из  этих  реконструированных  яйцеклеток  нормально  развивались, и  якобы  получены  четыре  взрослых  самки, но  в  свете  вышесказанного  эти  результаты  маловероятны.

Гибель  партеногенетических  (гиногенетических и  андрогенетических)  зародышей  у  млекопитающих  связана  с  различной  активацией  онтогенеза  материнского  и  отцовских  геномов. Механизм, регулирующий  эти  функциональные  различия, был  назван  геномным  импритингом  и  изучался  в  ряде  работ, где  было  показано, что  для  нормального  развития  млекопитающих  требуется  наличие  мужского  генома.

Другая  статья  Илменсе  и  Хоппе  имела  ещё  больший  резонанс. Авторы  сообщили  о  пересадки  ядер  внутренней  клеточной  массы   бластулы  в  энуклеированные  зиготы  мышей  и  получения  трёх  взрослых  особей  (двух  самок  и  одного  самца), генетически идентичной  донорской линии мышей. Введение  ядер-доноров и удаление  пронуклеусов  из  зиготы  проводили за  один  приём, затем реконструированные  яйцеклетки  культивировали  in  vitro   до  стадии  бластулы и пересаживали  в матку  самок. Из  16  пересаженных  бластул три развились во  взрослые  особи. В следующей работе  эти же  авторы  использовали  в качестве  доноров-ядер  клетки  эмбрионов ещё более поздней стадии (семь  суток)  и будто бы  получили  трёх  половозрелых  мышей. Однако  никто  из  работающих  в  том  же  направлении  не  смог  добиться  подобных  результатов, и  достоверность  результатов  Илменсе  и  Хоппе  вновь  была  поставлена  под  сомнение.

МакГрат  и  Солтер  показали, что  ядра  8-клеточных  зародышей и клеток  внутренней  клеточной массы бластулы  не  обеспечивают  развития  in  vitro  реконструированных  яйцеклеток  даже  до  стадии  морулы, которая предшествует  стадии  бластулы. Наибольшая  часть (5%) 4-клеточных зародышей даёт  возможность  развиваться  только  до  стадии  морулы. В  тоже  время  19%  реконструированных  яйцеклеток  2-ядерных  клеточных  зародышей, смогли  спокойно  достичь  стадии  морулы  или  бластулы.

Эти  и  другие  данные  показывают, что  в  эмбриогенезе  у  мышей клеточное ядро  рано  теряет  тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней  активизацией  генома  зародыша – уже на  стадиях двух  клеток. У других  млекопитающих, в частности у кроликов, овец  и крупного  рогатого  скота, активизация  первой  группы  генов  в  эмбриогенезе  происходит  позднее, на  8-16  клеточной  стадии. Возможно,  поэтому  первые  значительные  успехи  в  клонировании  животных  были  достигнуты  на  других  видах  млекопитающих, а  не  на   мышах.

Тем  не менее,  особый  интерес вызывают  опыты группы  учёных  из  университета  в Гонолулу  во  главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Уилмута, о котором речь  пойдёт  ниже, они отказались  от  электрической стимуляции  слияния  донорской  соматической  клетки  с  яйцеклеткой  и изобрели  такую  микропипетку, с  помощью  которой  можно  было  бы  безболезненно  извлекать ядро  из  соматической  клетки  и  трансплантировать  его  в  обезъядренную  клетку. Кроме  того, авторы  использовали  в  качестве  донорских  относительно  менее  дифференцированные  ядра  клеток, окружающих  ооцит.  Наконец, удалось,  как  бы  синхронизировать  процессы, протекающие  в  яйцеклетке  и  трансплантируемом  в  нём  ядре, что  позволило  обеспечить  естественные  ядерно-цитолазматические  взаимоотношения  между  ядром  и  цитоплазмой, поскольку  трансплантируемое  дифференцированное  в  определённом  направлении  ядро  и  цитоплазма  яйцеклетки  до  того  работали  как  бы  в  разных  режимах.

Авторы  использовали  для  трансплантации  ядра  клеток, окружающих  ооцит  (клеток  так  называемого  cumulus  oophorus), клеток  Сертоли из  семенников  и клеток, выделенных  из  мозга. Ядра, выделенные  из  соматических  клеток, инъецировали  в энуклеированное  яйцо  с  помощью  микропипетки. Яйцо  активировали  к  развитию, поместив  в  специальный  раствор  (так  называемый  HEPES-CZB), свободный от  кальция, и добавляя  стронций  и цитохалазин.Стронций  активировал яйцо, а кальций подавлял  образование  полярных  телец. Эмбрионов  культивировали  до  стадии  2-8  клеток, морулы  или  бластулы, а  затем трансплантировали  в  матку  приёмной  матери, где  многие  из  них  имплантировались  и  некоторые  из   них  (15-16%)  продолжали  своё  развитие. Процент  выхода  рождённых  мышат  (их  извлекали  с  помощью  кесарева  сечения  на  18, 5-19-й  дни  беременности)  был, однако, низок – в  разных  сериях  экспериментов  от  2  до  2,8%. Молекулярные  исследования  доказали  принадлежность ядер  рождённых  мышат  к  клеткам  донора  соматических  клеток.Таким  образом, по  крайней  мере  в  некоторых  случаях  доказана  способность  ядер  соматических  клеток  обеспечивать  нормальное  развитие  млекопитающих.

 Тем не  менее,  работы  с  мышами, несмотря  на  их  непростую  судьбу, значительно  расширили  наши  представления  о  методологии  млекопитающих.

                  Кролики  и  коровы.

Американские  исследователи  Стик  и  Робл, используя  метод  Солтера  и  МакГрата, получили  шесть  живых  кроликов, пересадив  ядра  8-клеточных  эмбрионов  одной  породы  в  лишённые  ядра  яйцеклетки  кроликов  другой  породы. Фенотип  родившихся  полностью  соответствовал  фенотипу  донора.

Однако  только  6  из  164  реконструированных  яйцеклеток  (3,7%)  развились в нормальных  животных. Это, конечно, очень низкий  выход, практически не  позволяющий рассчитывать  на  получение таким способом  клона генетически идентичных  животных. Ценность  этой  работы, тем не  менее,  в том, что она показала  возможность  клонирования  эмбрионов  кроликов.

Работа  с  реконструированными  яйцеклетками  крупных  домашних  животных, коров  или  овец, идёт  несколько  по-другому. Их  сначала  культивируют  не  in  vitro, а in  vivo – в перевязанном  яйцеводе  овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем  их  оттуда  вымывают  и  трансплантируют  в  матку  окончательного  (второго)  реципиента – коровы  или  овцы  соответственно, где  их  развитие  происходит  до  развитого  детёныша. Уиландсин  предложил  заключить  реконструированные  яйцеклетки  в  агаровый  цилиндр, который  он  потом  трансплантировал  в  перевязанный  яйцевод  овцы  или  коровы. По  данным  одних  авторов реконструированные  зародыши  лучше  развиваются  в  яйцеводе, чем  в  культивированной  среде, хотя  некоторые  исследователи  получили  неплохие  результаты  и  при  культивировании  in  vitro.

Американцы  Робл  и  его  сотрудники  использовали  щадящий  метод  извлечения  ядра  без  прокалывания  мембраны  яйцеклетки, предложенные  МакГратом  и  Солтером, пересаживали  в  зиготы  так  называемые  кариопласты – мужской  и  женский  пронуклеусы  вместе  с  окружающей  их  цитоплазмой, а  также  ядра  2-, 4-  или  8-клеточных  эмбрионов  коровы. Сначала  пронуклеусы  центрифигурировали, чтобы  освободить  пронуклеусы  от  окружающих  их  гранул  желтка, после  чего  ядра  были  хорошо  видны  под  микроскопом, что  значительно  облегчало  их  удаление. При  помощи  манипулятора  и  заострённой  стеклянной  пипетки  извлекали  один  из  бластомеров  вместе  с  ядром  из  ранних  зародышей  и  переносили  его  в  энуклеированную  зиготы

Реконструированные  зародыши  были  заключены  в  агаровый  цилиндр  и  пересажены  в  перевязанный  яйцевод  овцы. Через  пять  дней  культивирования  их  вымывали, освобождали  от  агара  и  исследовали. Реконструированные  зародыши  в  этом  случае  развивались  только  в  тех  случаях, где  зиготы  в  зиготы  пересаживали  пронуклеусы: 17%  таких  зародышей  достигли  стадии  морулы  или  бластулы. Два  зародыша  были  пересажены  второму  реципиенту – в  матку   коровы  и  развитие  их  завершилось  рождением  живых  телят. Если  в  качестве  доноров  использовали  ядра  2-, 4-  и  8-клеточных  зародышей, то  реконструированные  яйцеклетки  не  развивались  даже  до  стадии  морулы

Позже  были  и  более  успешные  работы. Уиландсин, в  частности,  сообщил, что  ему  удалось  получить  четырёх  генетически  идентичных  бычков  холстейской  породы  в  результате  пересадки  в  реципиентные  яйцеклетки  ядер  бластул  одного  32-клеточного  зародыша. Автор  утверждал, что  большинство  ядер  сохраняют  тотипотентность  на  32-клеточной  стадии, а  значительная  их  часть  64-клеточной  стадии, обеспечивая  нормальное  развитие  реконструированных  яйцеклеток  до  стадии  морулы  в  яйцеводе.  После  пересадки  в  матку  коров – окончательных  реципиентов. Как  полагает  автор, они  могут  и  дальше  нормально  развиваться.

Бондиоли  и  соавторы, используя  в  качестве доноров  ядер 16-64-клеточные  зародыши  коров, трансплантировали 463  реконструированных  зародыша  в матку синхронизированных  реципиентов, и было  получено   92  живых телёнка. Семь  из  них были  генетически   идентичны, представляя собой клон, полученный  в результате  пересадки ядер  клеток  одного  донорского  эмбриона.

Таким  образом,  клеточные  ядра  зародышей  крупного  рогатого  скота  достаточно  долго  сохраняют  тотипотентность  и  могут  обеспечить  полное  развитие  реконструированных  яйцеклеток. Иначе  говоря, методические  трудности  клонирования  зародышей  крупного  рогатого  скота  практически  решены. Но  остаётся  основная  задача – найти  донорские  ядра, обладающие  тотипотентностью, для  клонирования  взрослых  животных.