Клонирование животных

                              Введение.

Проблема  клонирования  животных  приобрела  в  последнее  время  не  только  научное, но  и  социальное  звучание, поэтому  оно  широко  освещается  в  СМИ, зачастую  некомпетентными  людьми  и  с  непониманием  сути  проблемы. В  связи  с  этим  возникает  необходимость  осветить  положение  дела.

Термин  клон  происходит  от  греческого  слова  «klon», что  означает  веточка, побег, отпрыск. Клонированию  можно  давать  много  определений, вот  некоторые  самые распространенные  из  них, клонирование – популяция клеток  или организмов  произошедших  от  общего  предка  путём бесполого размножения, причём  потомок при этом  генетически идентичен своему  предку.

Воспроизводство  организмов  полностью  повторяющих  особь, возможно  только  в  том  случае, если  генетическая  информация  матери  будет  без каких-либо  изменений  передана  дочерям. Но  при  естественном  половом  размножении  этому  препятствует  мейоз. В  ходе  этого  незрелая  яйцеклетка, имеющая  двойной, или  диплоидный  набор  хромосом – носителей  наследственной  информации – делиться  дважды  и  в  результате  образуются  четыре  гаплоидных, с  одинарным  набором  хромосом, клетки. Три  из  них  дегенерируют, а  четвёртая  с  большим  запасом  питательных  веществ, становится  яйцеклеткой. У  многих  животных  она  в  силу  гаплоидности  не  может  развиваться  в  новый  организм. Для  этого  необходимо  оплодотворение. Организм, развившийся  из  оплодотворенной  яйцеклетки, приобретает  признаки, которые  определяются  взаимодействием  материнской  и  отцовской  наследственности. Следовательно, при  половом  размножении  мать  не  может  быть  повторена  в  потомстве.

Как  же  вопреки  этой  строгой  закономерности  заставить  клетку  развиваться  только  с  материнским  диплоидным  набором  хромосом? Теоретически  решение  этой  трудной  биологической  проблемы  найдено.

                                        Растения.

Клонирование,  прежде  всего,  изначально  относится  к  вегетативному  размножению. Клонирование  растений  черенками, почками  или  клубнями  известно  уже  более  4  тысяч  лет. Начиная  с  70-х  гг.  нашего  столетия  для  клонирования  растений  стали  широко  использовать  небольшие  группы  и  даже  соматические (неполовые)  клетки.

Дело  в  том, что  у  растений  в  отличие  от  животных  по  мере  их  роста, в  ходе  клеточной  специализации  – дифференцировки – клетки  не  теряют  так  называемые  тотипотентные  свойства, то  есть,  не  теряют  своей  способности  реализовывать  всю  генетическую  информацию, заложенную  в  ядре. Поэтому  практически  любая  растительная  клетка, сохранившее  в  процессе  дифференцировки  своё  ядро, может  дать  начало  новому  оргазму. Эта  особенность  растительных  клеток  лежит  в  основе  многих  методов  генетики  и  селекции.

При  вегетативном  размножении  и  при  клонировании  гены  не  распределяются  по  потокам, как  в  случае  полового  размножения, а  сохраняются  в  полном  составе  в  течение  многих  поколений.. Всё организмы, входящие  в состав  определённого клона имеют одинаковый  набор генов и фенотипически не  различаются между собой.

Клетки  животных, дифференцируясь, лишаются  тотипотенстности, и  в  этом, одно  из  существенных  отличий  от  клеток  растений. Как  будет  показано  ниже  именно  здесь  главное  препятствие  для  клонирования  взрослых  позвоночных  животных.

              Клонирование  шелкопряда.

В  изобретение  клонирования  животных,  несомненно,  надо  отдать  должное  русским учёным. Сто лет тому  назад русский зоолог  московского университета  А.А. Тихомиров впервые открыл, что яички тутового  шелкопряда  в результате  различных химических  и физических  воздействий начинают  развиваться без оплодотворения.

Однако  это  развитие, названное  партеногенезом, рано  останавливалось: партеногенетические  эмбрионы  погибли  ещё  до  вылупления  личинок  из  яиц. Но  это  уже  была  прелюдия  к  клонированию  животных.

БЛ.Л. Астауров  в  30-е  гг.  в  результате  длительных  исследований, получивших  мировую  известность, подобрал  термическое  воздействие, которое  одновременно  активизировало  неоплодотворённое  яйцо  к  развитию  и  блокировало  стадию  мейоза, то  есть  превращение  диплоидного  ядра  яйцеклетки  в  гаплоидное. Развитие  с  ядром, оставшимся  диплоидным, заканчивалось  вылуплением  личинок, точно  повторяющих  генотип  матери, включая  и  пол. Так, в  результате  амейотического  партеногенеза   были  получены  первые  генетические  копии, идентичные  матери.

Количество  вылупившихся  партеногенетических  гусениц  находилось  в  зависимости  от  жизнеспособности  матери.

Поэтому  у  «чистых»  пород  былупление  гусениц  не  превышало  1%, в  то  время  как  у  значительно  более  жизнеспособных  межрасовых  гибридов  оно  достигло  40-50%. Несмотря  на  огромный  успех, автор  этого  метода  пережил  горькое  разочарование: партеногенетическое  потомство  характеризовалось  пониженной  жизнеспособностью  на  эмбриональных  и  постэмбриональных  стадиях развития  (гусеницы, куколки, бабочки). Гусеницы  развивались неравномерно, среди них было  много уродливых, а завитые ими коконы  различались по  массе. Позже Астауров  улучшил метод, применив  гибридизацию  между селекционными линиями. Так  он  смог  повысить  жизнеспособность  у  новых  клонов  до  нормы, но  довести  до  этого  уровня  другие  количественные  признаки  ему  не  удалось: например  масса  партеногенетических  коконов  не  превышала  82%  от  массы  нормальных  коконов  такого  же  генотипа.

Позднее  установили  причины  партеногенетической  депрессии  и  сложными  методами, которые  позволили  накапливать  «гены  партеногенеза», вывели  новые  высоко жизнестойкие  клоны  самок, а  позднее  и  партеногенетических  самцов. Скрещивая  таких  самцов  со  своими  «матерями»  или  склонными  к  партеногенезу  самками  других  клонов, получили  потомство  с  ещё  большей  склонностью  к  партеногенезу. От  лучших  в  этом  отношении  самок  закладывали  новые  клоны.

В  результате  многолетнего  отбора  удалось  накопить  в  генотипе  селекционируемых  клонов  невиданно  большое  число  генов, обуславливающих  высокую  склонность  к  партеногенезу. Вылупление  гусениц  достигло  90%, а  их  жизнеспособность  повысилась  до  95-100%, опередив  в этом  отношении обычные породы  и гибриды. В дальнейшем  «скрестили» с помощью партеногенетических самцов  два генетически резко отличающихся  клона разных  рас и от  лучших  гибридных самок вывели  сверхжизнеспособные клоны.

Наконец, научились  клонировать  самцов  тутового  шелкопряда. Это  стало  возможным  после  того, как  удалось  получить  самцов, у  которых  все  парные  гены  были  идентичными, или  гомозиготными. Вначале  таких  самцов  клонировали  особым  мужским  партеногенезом (андрогенезом). Для  этого  воздействием  гамма-лучей  и  высокой  температуры  лишали  ядро  яйца  способности  к  оплодотворению. Ядро  проникшего  в  такое  яйцо  сперматозоида, не  встретив  дееспособного  женского  ядра, само, удваиваясь, приступало  к  развитию  мужского  зародыша, который  естественно  повторял  генотип  отца. Таким  способом  ведутся  мужские  клоны  в  десятках  поколениях. Позже  один  из  таких  клонов  был  преобразован  в  обоеполовую  линию, также  состоящих  из  генетически  идентичных  (за  исключением  половых  хромосом)  теперь  уже  самок  и  самцов. Поскольку  положивший  начало  этой  линии  полностью  гомозиготный  отец  возник  в  результате  размножения, приравненного  к  самооплодотворению, то  сам  он  и  линия  двойников  обоего  пола  имеют  пониженную  жизнеспособность. Скрещивая  между  собой  две  такие  линии, стали  без  труда  получать  гибридных  и  высоко  жизнеспособных  двойников  в  неограниченном  количестве.

Итоги  клонирования  шелкопряда: полученные  клоны  самок  и  самцов  тутового шелкопряда  для  практического  шелководства  непригодны, но  это  не  крах  всех  надежд. Целесообразно  использовать  клоны  не  для  непостредственноо  применения  в  шелководческой  практике, а  на  племя для выдающегося по  продуктивности  потомства. Примерная схема использования клонов  в промышленном  производстве  выглядит  следующим образом. Из  большого  количества  коконов выбирают  те, из  которых развиваются выдающиеся  по  продуктивности  самки, и  от  каждой  получают  партеногенетическое  потомство, для  дальнейшей  работы  используют  партеногенетических  клоны, которые  повторяют  высокую  продуктивность  матери  и  проявляют  высокую  склонность  к  партеногенезу. За   этим следует скрещивание с определёнными клонированными  самцами и из  полученного гибридного  поколения выбирают  два производства, только  те  клоны, которые дали  прекрасное  во  всех  отношениях  потомство. Его высокие качества  обусловлены не  только  предшествующей  селекцией, а ещё и тем, что в процессе  отбора  особей  на  высокую склонность  к партеногенезу в их  генотипе  образуется  комплекс  генов жизнеспособности, компенсирующей  вредное влияние искусственного  размножения. При переводе  клонов  на  половое размножение этот  комплекс, оказавшись  несбалансированным, сильно  повышает  гетерозис.

             Первые  опыты  на  амфибиях

Возможность  клонирования    эмбрионов  позвоночных  впервые  была  показана  в  конце  40-х  начале  50-х  гг.  в  опытах  на  амфибиях, когда  российский  эмбриолог  Георгий  Викторович  Лопашов  разработал  метод  пересадки  (трансплантации)  ядер  в  яйцеклетку  лягушки. В  июне  1948  года  он  отправил  в  «Журнал  общей  биологии»  статью, написанную  по  материалам  собственных экспериментов. Однако  на  беду  Лопашова  в августе 1948  года  состоялась  печально  известная сессия  ВАСХНИЛ, утвердившая по  воле  коммунистических  вождей  беспредельное господство  в биологии малограмотного  агронома  Т.Д. Лысенко, и набор статьи  Лопашова, принятой  к печати, был рассыпан, потому  что она доказывала  ведущую роль  ядра  и содержащихся  в нём хромосом  в индивидуальном  развитии  организмов. Работу  Лопашова  забыли, а в 50-х гг.  американские  эмбриологи  Бриггс  и Кинг  выполнили сходные опыты, и приоритет достался  им, как это часто случалось в истории российской  науки.

Бриггс  и  Кинг  разработали  микрохирургический  метод  пересадки  ядер  эмбриональных  клеток  с  помощью  тонкой  стеклянной  пипетки  в  лишённые  ядра  клетки (энуклеированные  клетки).

Они  установили, что  если  брать  ядра  из  клеток  зародыша  на  ранней  стадии  его  развития – бластуле (бластула – стадия  в  развитии  зародыша, представляющая  собой  полный  шар  из  одного  слоя  клеток), то  примерно  в  80%  случаях  зародыши  благополучно  развиваются  дальше  и  превращаются  в  нормального  головастика. Если  же  развитие  зародышей  продвинулось  на  следующую  стадию – гастулу, то  лишь  менее  чем  в  20%  случаев  оперированные  клетки  развивались  нормально. Эти  результаты  позже  были  подтверждены  в  других  работах.

Большой  вклад  в  эту  область  внёс  английский  биолог  Гёрдон. Он  первый  в   опытах  с  южноафриканской жабой   Xenopus  laevis  в качестве  донора  ядер  использовал не  зародышевые клетки, а уже вполне  специализировавшиеся  клетки  эпителия  кишечника плавающего  головастика. Ядра  яйцеклеток-реципиентов он  не  удалял  хирургическим  путём, а  разрушал  ультрафиолетовыми лучами. В  большинстве  случаев  реконструированные  яйцеклетки  не  развивались, но  примерно  десятая  часть  из  них  образовывала  эмбрионы, 5%  из  этих  эмбрионов  достигалы  стадии  бластулы, 2,5% стадии  головастика  и  только  1%  развивалось  в  половозрелые особи  (схема)  однако  появление  нескольких  взрослых  особей  в  таких  условиях  могло  быть  связано  с тем, что  среди  клеток  эпителия  кишечника  развивающегося  головастика  довольно  длительно  присутствуют  первичные  половые  клетки, ядра,  которых  могли  быть  использованы  для  пересадки. В  последующих  работах, как  самого  автора, так  и  других  исследователей  не  смогли  подтвердить  данные  этих  первых  опытов.

Позже  Гёрдон  модифицировал  эксперимент. Поскольку  большинство  реконструированных  яйцеклеток  с  ядром  клетки  кишечного  эпителия  погибают  до  завершения  стадии  гастулы, он  попробовал  извлечь  из  них  ядра  на  стадии  бластулы  и  снова  пересадить  их  в  новые  энуклеированные  яйцеклетки, такая  процедура  называется  «серийной  пересадкой». Число  зародышей  с  нормальным  развитием  после  этого  увеличилось,  и  они  развивались  до  более  поздних  стадий  по  сравнению  с  зародышами, полученными  в   результате  первичной пересадки ядер.

Затем  Гёрдон  вместе  с  Ласки  (1970 г од)  стали  культивировать  in  vitro  (вне организма в питательной среде)  клетки  почки, лёгкого и кожи  взрослых  животных  и использовать  уже эти клетки  в качестве  доноров  ядер. Примерно  25%  первично  реконструированных  яйцеклеток  развивались  до  стадии  бластулы. При  серийных  пересадках  они  развивались  до  стадии  головастика. Таким  образом,  было  показано, что  клетки  3-х  разных  тканей  взрослого  позвоночного  содержит  ядра, которые  могут  обеспечить  развитие  по  крайней  может   до  стадии  головастика.

В  свою  очередь  ДиБерардино  и  Хофнер  использовали  для  трансплантации  ядра  неделящихся  и  полностью  дифференцированных  клеток  крови – эритроцитов  лягушки  Rana  Pipiens. После серийной  пересадки таких ядер  10%  реконструированных  яйцеклеток  достигали стадии  плавающего  головастика. Однако  даже  с помощью многократных  серийных  пересадок (более 100  клеточных циклов)  реконструированные  яйцеклетки  дальше  стадии  головастика  не  развивались.

Таким  образом,  во  многих  работах  показано, что  в  случаи  амфибий  донорами  ядер  могут  стать  лишь  зародыши  на  ранних  стадиях  развития.. Некоторые  авторы  называют  подобные  эксперименты  клонированием  амфибий, хотя  правильнее  их  называть  клонированием  эмбрионов  амфибий, так  как  в  этом  случае  размножают  бесполым  путём  не  взрослых  животных, а  их  зародышей.

Дифференцировка  клеток  в  ходе  развития  позвоночных  сопровождается  инактиваций  неработающих  генов, поэтому  клетки  теряют  тотипотентность, дифференцировка  становится  необратимой. В  конце  концов,  у  одних  клеток  происходит  репрессирование  генома, у  других  в  той  или  иной  степени  деградирует  ДНК, а  в  некоторых  случаях  разрушается  даже  ядро. Однако  на  ряду  с  дифференцируемыми  клетками, культивируемыми  in  vitro  клеточные  популяции  содержат  малодифференцируемые  стволовые  клетки, которые  и  могут  быть   использованы  как  доноры  ядер  для  клонирования  млекопитающих.

Опыты  с  амфибиями  показали, что  ядра  различных  клеток  одного  и  того  же  организма  генетически  идентичны  и  в  процессе  дифференцирвки  постепенно  теряют  способность  обеспечивать  развитие  реконструированных  яйцеклеток, однако  серийные  пересадки  ядер  и  культивирование  клеток  in  vitro  в какой-то  степени увеличивают эту способность.