Трансгенные животные

Рекомбинантные гены вводят в такие клетки любым из вышеупомянутых способов, а кроме того, электропорацией или другими стандартными методами, применяемыми для доставки генов в культивируемые соматические клетки. При этом вместе с исследуемыми генами возможно введение селектируемых маркеров, которые позволяют проводить отбор клеток, экспрессирующих данные маркеры и, следовательно, гарантированно содержащих сцепленные с ними исследуемые гены. Отобранные таким образом клетки переносят в бластоцисты развивающихся эмбрионов или используют для получения агрегационных химер объединением их с клетками восьмиклеточных эмбрионов с последующей пересадкой эмбрионов псевдобеременным самкам.

При трансфекиии ЕS-клеток в культуре век­тором, предназначенным для интеграции в спе­цифический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ЕS-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называе­мую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции кле­ток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт.

Сайт-мишень должен находиться в такой об­ласти геномной ДНК, которая не кодирует важ­ных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточ­ные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансля­цию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

Вектор для позитивно-негативной селекции обычно содержит следующие элементы: I) два блока последовательностей (НВ1 и НВ2), гомо­логичных отдельным участкам сайта-мишени; 2) трансген (ТG), кодирующий новую функцию реципиента; 3) последовательность, кодирую­щую устойчивость к соединению G-418 (Nеоr); 4) два разных гена тимидинкиназы (tk1 и tk2) ви­руса простого герпеса типов 1 и 2 (HVS-tk1 и HVS-tk2) (рис. 5, А). Ключевым для позитив­но-негативной селекции является взаимное рас­положение этих элементов. Трансген и ген ус­тойчивости к G-418 (Neоr) должны находиться между двумя участками ДНК, гомологичными сайту-мишени, а гены HVS-tk1 и HVS-tk2 - по бокам этой конструкции. Если встраивание происходит в случайный сайт (не в НВ1 и НВ2), то с высокой вероятностью вместе с другими по­следовательностями интегрируют один или оба гена НVS-tk (рис. 5, А). Напротив, если инте­грация происходит в результате гомологичной рекомбинации путем двойного кроссинговера в нужный сайт, то в геном встроятся только трансген и ген Neоr, а гены НVS-tk — нет (рис. 5, Б). При выращивании трансфицированных клеток в присутствии G-418 клетки, не не­сущие ген Neоr, расти не будут. Выживут только клетки, в которых произошла интеграция - иными словами, осуществляется позитивная се­лекция. Если одновременно с G-418 в среду добавить ганцикловир, то рост клеток, синтези­рующих тимидинкиназу, будет подавлен, по­скольку этот фермент катализирует превраще­ние ганцикловира в токсичное соединение, летальное для клетки, т. е. произойдет негатив­ная селекция. Клетки, прошедшие через такое двойное сито, скорее всего будут содержать пос­ледовательность, встроившуюся в нужный сайт. Хоть этот метод не застрахован от ошибок, он позволяет обогатить клеточную популяцию клетками, несущими трансген в специфичном хромосомном сайте.

Электропорация

Этот метод основан на способности клеточной мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения. Когда различия в потенциалах на внешней и внутренней поверхности мембраны превысят определенный уровень, формируются временные поры, через которые способны проходить экзогенные молекулы. Изменение количества пор в мембране обратимо при условии, что величина или продолжительность импульсов высокого напряжения не превысит критического предела. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды.

Электропорация.

Электропорация была проведена, например, для эмбрионов креветки и моллюсков. Недостатком использования электропорации является постепенная деградация и уменьшение экспрессии трансгена со временем.

Биобаллистическая трансформация

Суть метода биобаллистической трансформации заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, платины или золота, диаметром от 0,1 до 3,5 мкм, напыляется векторная ДНК, содержащая необходимую для трансформации генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Суспензия животных клеток или эмбрионов, на ранней стадии развития, помещается под биобаллистическую пушку на расстоянии 10-25 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из пушки и, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления частичек металла, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра будут находиться трансформированные клетки (Рис.3). Далее клетки или эмбрионы животных переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.
            Бомбардировка микрочастицами была использована, например, для трансформации оплодотворенных яйцеклеток креветки, морского ежа. Процент выживших клеток после бомбардировки составляет приблизительно 70%, а также была доказана экспрессия трансгена у некоторых разновидностей рыб.
Главным преимуществом данного метода является высокая эффективность встройки векторной ДНК, а также то, что можно получить трансгенные клетки в самые кратчайшие сроки.

Биобаллистическая трансформация.

Существенным недостатком этого метода является то, что эмбрионы, подвергшиеся бомбардировке, довольно редко развиваются в полноценных взрослых особей, большая часть из них рано или поздно гибнет.

Липофекция
            Липосомы - это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов.
             Метод липофекции основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами ДНК. В настоящее время предложены три модели ассоциаций между ДНК и фосфолипидами . Суть первой модели состоит в том, что положительно заряженные липосомы присоединяются к отрицательно заряженным молекулам ДНК. Число липосом, присоединившихся к ДНК, зависит от размеров молекулы нуклеиновой кислоты. Во втором случае молекулы ДНК "проглатываются" липосомами, то есть ДНК электростатически взаимодействует с внутренней поверхностью липосомы. В третьем случае молекула ДНК окружена несколькими молекулами фосфолипидов, которые формируют своеобразную ленту с нуклеиновой кислотой.

Липофекция (2-я модель).

Липосомы, несущие положительный заряд, легко присоединяются к несущей отрицательный заряд плазматической мембране животных клеток, после чего путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клеток. Механизмы же, обеспечивающие встраивание в геном и экспрессию ДНК, не достаточно изучены.
К преимуществам данного метода можно отнести низкую токсичность липосом по отношению к клеткам, а также то, что экзогенный генетический материал защищен от действия нуклеаз посредством транспортировки в липосомах. Недостатком данного метода является то, что количество личинок, экспрессирующих трансген сокращается с возрастом.

Более простой способ идентификации ЕS-клеток, несущих трансген в нужном сайте, осно­ван на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последова­тельности, отсутствующей в геноме мыши (рис. 6). После трансфекции ЕS-клеток этим век­тором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникаль­ной) нуклеотидной последовательности интег­рировавшего вектора, а второй (Р2) — участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовы­ваться не будет (рис. 6, А), а при сайт-специ­фической интеграции в результате ПЦР-ампли­фикации образуется фрагмент ДНК известного размера (рис. 6, Б), Таким образом можно идентифицировать пулы ЕS-клеток, содержа­щих трансген в нужном сайте, а пересевая клет­ки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

ЕS-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать такие эмбрионы в матку псевдобе­ременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ЕS-клетки участвовали в образовании клеток заро­дышевой линии, могут дать начало трансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены трансгенные мыши, гомозиготные по трансгену.

В специфический хромосомный сайт ЕS-клеток можно не только встроить трансген, ко­дирующий какую-то новую функцию, но и на­правленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркер­ного гена) (рис. 7). Одна из задач направлен­ного нарушения («нокаута») гена состоит в исследовании влияния этого процесса на разви­тие организма и протекающие в нем физиологи­ческие процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в опреде­ленном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне.

Например, направленный «нокаут» гена ро­допсина мыши приводит к инактивации пало­чек сетчатки, что имитирует такую болезнь че­ловека, как пигментный ретинит. На мышах с «нокаутированным» геном родопсина можно изучать процесс дегенерации сетчатки, а также терапевтический эффект лекарственных средств, замедляющих или вообще останавливающих ге­нетически обусловленный патологический про­цесс. Уже создано более 250 линий мышей с «но­каутированными» генами, используюшихся в качестве моделей для изучения различных забо­леваний человека.

В принципе подходы к созданию трансгенных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ЕS-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рога­того скота, овей, свиней и цыплят, но их поиск продолжается.

Рис. 4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых клеток.

Рис. 5. Позитивно-негативная селекция. А. Неспецифическая интеграция. В хромосому встроились оба гена тимидинкиназы (tk1 и tk2), два участка ДНК, гомологичные специфичным последовательностям хромосомной ДНК реципиентных клеток (НВ1 и НВ2), ген (Neor), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому соеди­нению G-418, и трансген (ТG). После трансфекции проводят тестирование клеток на устойчивость к G-418 и ганцикловиру, который становится цититоксичным для клеток, синтезирующих тимидинкиназу. Интеграция может произойти и по-другому, со встраиванием в хромосому только гена тимидинкиназы. В присутствии G-418 и ганцикловира все такие клетки тоже погибают. Б. Специфическая интеграция с помощью гомологичной рекомбина­ции. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками (НВ1 и HB2) векторной и хромосом­ной ДНК в последнюю встраивается фрагмент, не содержащий генов тимидинкиназы (tk1 и tk2). В присутствии G-418 и ганцикловира выживают только клетки, в которых прошла гомологичная рекомбинация.

Рис. 6. Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результа­те неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участ­ком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужно­го размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (US) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципнента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы СS1 и СS2, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые нахо­дятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одно­го размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (ТG), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встро­ился в определенный сайт хромосомы.

Рис. 7. «Нокаут» гена с помощью направленной гомологичной рекомбинации. Вектор несет селективный маркерный ген (smg) и фланкирующие его последовательности, гомологичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять экзонов (1 – 5). В результате гомологичной рекомбинации (штриховые линии) ген-мишень прерывается («нокаутируется»).

Клонирование с помощью переноса ядра

Плюрипотентность можно выявить, если пере­нести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способ­ность последней к развитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких ла­бораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбриональных кле­ток, клеток плода и взрослой особи. Было пока­зано, что ядра эмбриональных клеток способны - хотя и с низкой эффективностью — обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи. Всем известная овца по имени Долли была кло­нирована с помощью переноса ядра клетки молочной железы (вымени) взрослого животного (рис. 8). Так впервые была доказана плюрипотентность ядра дифференцированной взрос­лой клетки. Впрочем, нельзя исключить, что на самом деле донорское ядро было взято из не­дифференцированной клетки, присутствовав­шей в эпителии молочной железы организма-донора.

Клонирование Долли из ядра дифференци­рованной клетки и трех других овец из ядер эмб­риональных клеток удалось осуществить благо­даря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы, за­нимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время вве­денная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответству­ющие гены эмбрионального развития связыва­ются с инициаторными эмбриональными бел­ковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.

Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных живот­ных с помощью метода переноса ядер стало ре­альным, — это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удаст­ся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных организмов станет почти рутинной процедурой. Однако вследствие видо­вых различий во времени процесса деления клетки на ранних стадиях эмбриогенеза и ини­циации транскрипции в этот период пока не яс­но, удастся ли осуществить перенос ядра в слу­чае каких-либо других домашних животных, кроме овец, если донорское ядро будет находит­ся на той же стадии, что и яйцеклетка.