Трансгенные животные

ВВЕДЕНИЕ

Многоклеточный организм высших животных и растений является продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы), образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родителей (гамет), путем большого числа дроблений образуется вся совокупность высокодифференцированных клеток органов и тканей организма. Поскольку любая соматическая клетка или клетка зародышевого пути, в конечном счете, берет свое начало от двух объединившихся родительских клеток, она, как правило, заключает в себе всю (или большую часть) генетическую информацию родительских организмов. Несмотря на то что эта схема является упрощенной и по мере развития дифференцированного состояния соматических клеток их генетический материал часто претерпевает необратимые перестройки (например эритроциты человека вообще лишены ядер), такая картина подчеркивает преемственность генетического материала в рядах клеточных поколений соматических клеток организмов.

Почти все гены зигот имеют хорошие шансы быть представленными в большинстве соматических клеток организма и принять участие в формировании их генотипа и фенотипа. Предпосылки такого рода привели к мысли о возможности изменения фенотипа многоклеточных организмов путем введения новых рекомбинантных генов в геном зигот, еще не претерпевших дробления в раннем эмбриональном развитии. В случае объединения с геномом зиготы новые гены должны распространиться в ряду клеточных поколений соматических клеток и экспрессироваться в большинстве этих клеток. Поскольку, с известными ограничениями, весь многоклеточный организм можно рассматривать как клон соматических клеток, произошедших от единственной клетки, распространение рекомбинантных генов, введенных в зиготу, в соматических клетках организма допустимо рассматривать как разновидность молекулярного клонирования последовательностей ДНК.

Такой молекулярно-генетический подход к изменению генотипа и фенотипа многоклеточных организмов был реализован экспериментально в середине 1970-х годов. Заражение мышиных эмбрионов на предимплантационной стадии развития вирусом лейкоза мышей (MuLV) приводило к образованию взрослых особей, содержащих вирусную ДНК, интегрированную в геном как соматических клеток, так и клеток зародышевого пути, и эта ДНК передавалась из поколения в поколение. Гены, искусственно введенные в геном многоклеточных организмов и передающиеся от родителей потомству, получили название трансгенов, процесс такого введения и передачи генов обозначили трансгенозом, а животные или растения, содержащие трансгены в геноме своих клеток, стали называть трансгенными. Развитие техники создания трансгенных животных и растений привело к возникновению нового быстро развивающегося направления молекулярной генетики. Были получены уникальные знания об особенностях экспрессии генов и биосинтезе белков в онтогенезе многоклеточных организмов, а также о возможности изменения фенотипа трансгенных организмов, в том числе и коррекции мутантного фенотипа, и использования трансгенных организмов для решения задач биотехнологии, связанных с биосинтезом рекомбинантных белков.

Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удой­ностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) в основном проводят множество раундов скрещиваний и отбора, ка­ждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и от­бора, требующая больших временных и матери­альных затрат, оказалась тем не менее исклю­чительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения но­вых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора ста­новится все труднее. Так, линия с новым «цен­ным» геном может нести также и «вредные» ге­ны, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенны­ми в том, что новая, улучшенная линия сохра­нит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно но­вую стратегию.

Успешные эксперименты по введению чуже­родных генов в клетки млекопитающих и воз­можность создания генетически идентичных животных путем переноса ядра из эмбриональ­ной клетки в яйцеклетку с удаленным ядром (перенос ядра, клонирование) позволили вклю­чать в хромосомную ДНК высших животных от­дельные функциональные гены или целые их кластеры. Используемая стратегия состоит в следующем.

•  Клонированный ген вводят в ядро оплодо­творенной яйцеклетки.

•  Инокулированные оплодотворенные яйце­клетки имплантируют в реципиентную жен­скую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно).

•  Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках.

•  Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Такой подход имеет много практических при­ложений. Например, если продукт вводимого ге­на стимулирует рост, то трансфицированные жи­вотные будут расти быстрее при меньшем количестве пищи. Повышение эффективности усвоения пищи всего на несколько процентов может существенно снизить стоимость конечно­го продукта (говядины, свинины и т. д.).

Идея генетического изменения животных путем введения генов в оплодотворенные яйцеклетки бы­ла реализована на практике в 1980-х гг. Эксперименты по генетической модифика­ции многоклеточных организмов путем введе­ния в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетиче­ской модификации клеток молочных желез жи­вотных с целью получения с молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин «фарминг», относящийся к процессу по­лучения из молока трансгенных домашних животных аутентичных белков челове­ка или фармацевтических препаратов. Использо­вание молока целесообразно потому, что оно об­разуется в организме животного в большом количестве и его можно надаивать по мере на­добности без вреда для животного. Вырабатывае­мый молочной железой и секретируемый в моло­ко новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на нормальные фи­зиологические процессы, протекающие в орга­низме трансгенного животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые по крайней мере близки к таковым в клетках челове­ка. Кроме того, его выделение из молока, которое содержит и другие белки, не должно составлять большого труда.

Трансгенные мыши: методология

Трансгенные технологии разрабатывались и со­вершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в зна­чительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухо­лей, природы иммунологической специфично­сти, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процес­сов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в ис­следовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в созда­нии трансгенных линий, позволяющих модели­ровать различные генетические болезни челове­ка. Введение чужеродной ДНК мышам можно осуществить разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед им­плантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйце­клетки; 3) введением генетически модифициро­ванных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Использование ретровирусных векторов

Более простым способом доставки чужеродных генов в геном животного-реципиента является использование векторов на основе вирусов (рис. 1). В этом случае эмбрионы на ранней (восьмиклеточной) стадии развития инкубируют в культуральной среде в присутствии фибробластов, в которых образуются рекомбинантные ретровирусы, и после заражения такими вирусами эмбрионы пересаживают псевдобеременным самкам мышей, где они продолжают свое развитие. Кроме простоты одним из преимуществ данного способа введения ДНК является то, что в геном клеток зародышей интегрируется, как правило, одна копия исследуемого гена, фланкированного длинными концевыми повторами вирусной хромосомы, что может способствовать эффективной экспрессии гена. Однако к недостаткам метода следует отнести необходимость проведения дополнительных генно-инженерных манипуляций при подготовке ретровирусного вектора, ограниченную емкость вектора (размер вставки – до 10 т.п.о.), вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегаю­щих регуляторных последовательностей, необ­ходимых для его экспрессии, и мозаицизм образующихся трансгенных животных, которые состоят из клеток как содержащих, так и не содержащих трансгены.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефект­ными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совер­шенно недопустимо, если этих животных пред­полагается использовать в пищу или как инстру­мент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко ис­пользуются для создания трансгенных живот­ных, имеющих коммерческую ценность.

Рис. 1. Получение трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов.

Метод микроинъекций ДНК

В настоящее время для создания трансгенных мы­шей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следуюшем (рис. 2).

1.   Увеличение числа яйцеклеток, в которых бу­дет инъецирована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок-доно­ров. Сначала самкам вводят сыворотку бере­менной кобылы, а спустя примерно 48 ч — хорионический  гонадотропин человека.  В результате гиперовуляции образуется при­мерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5—10.

2.   Скрещивание с самцами самок с гиперовуля­цией и их умерщвление. Вымывание из яйце­водов оплодотворенных яйцеклеток.

3.   Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яй­цеклетки — как правило, сразу после выделения. Часто вводимая трансгенная конструкция нахо­дится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (муж­ской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно го­раздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно пере­мещать, ориентировать нужным образом и фик­сировать. Опытный экспериментатор за день мо­жет инокулиронать несколько сотен яйцеклеток.

После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание – это единственный известный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.

Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы опре­делить, находится ли трансген в клетках зароды­шевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно про­водить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий.

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвали­фицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в луч­шем случае лишь из 5% инокулированных яйце­клеток (рис. 3). Ни один из этапов экспери­мента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать большое число оплодотворенных яйцеклеток. На­пример, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оп­лодотворенных яйцеклеток; мышата развива­ются примерно из 25% имплантированных яй­цеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцекле­ток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегриро­вать в любое место в геноме, и зачастую множе­ство ее копий включаются в один сайт. И нако­нец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интегра­ции, а в организме других число копий чуже­родного гена может оказаться слишком боль­шим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологиче­ских процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получе­ния линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто.

Рис. 2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций.

Рис. 3. Суммарная эффективность трансгеноза после микроинъекций. Все оплодотворенные яйцеклетки (100 %) коровы, свиньи, овцы и мыши инокулировали трансгеном, однако успешная имплантация и появление потомства были редкими событиями: трансгенное потомство давали менее 5% обработанных яйцеклеток.

Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток      

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбрио­нальными стволовыми клетками (ЕS). ЕS-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт не­существенного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно ото­брать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных жи­вотных (рис. 4). Это позволяет избежать слу­чайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных си­стем.