Автор: Пользователь скрыл имя, 08 Апреля 2012 в 08:52, реферат
Нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается различного рода экссудатов, мазков из различных органов и тканей. Мазки готовят различно. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят каплю его на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного); если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки.
1. Введение
2. Методы окраски микробов
3. Простые методы окраски
3.1.Окраска основным фуксином по Пфейферу
3.2 Окраска метиленовым синим Лефлера
3.3 Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
4. Сложные методы окраски микробов
4.1.Окраска по Граму
4.2.Окраска карболовым тионином Николя
4.3 Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
4.4. Окраска по Романовскому-Гимзе
4.4.1. Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза….
5. Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)
6. Выявление жгутиков и ресничек
7. Выявление капсул бактерий
8. Выявление спор бактерий
9. Выявление возбудителей сыпного тифа и других риккетсий
10. Выявление коринебактерий дифтерии
11. Выявление анаэробных спорообразующих бактерий группы клостридии
12. Список литературы
Результат: споры окрашиваются в красный цвет, бактерии - в синий.
1. Фиксированные мазки помещают на 2 мин. в хлороформ.
2. Переносят в 5 % водный раствор хромовой кислоты на 2 — 10 мин.
3. Промывают в проточной воде и окрашивают карболовым фуксином 1 мин (стекло при этом подогревают на горелке до появления паров).
4. Дифференцируют в 5 % серной кислоте 5 с.
5. Хорошо промывают в проточной воде и подкрашивают водным раствором метиленового синего 3 мин.
6. Промывают в проточной воде, сушат и изучают при иммерсии.
Результат: опоры окрашиваются в красный цвет, бактерии — в синий.
1. Мазки, фиксированные над огнем, окрашивают 5 % водным раствором малахитового зеленого 5—10 мин.
2. Промывают в проточной воде.
3. Докрашивают 1 % водным раствором сафранина 30 с.
4. Промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.
Результат: споры окрашиваются в зеленый цвет, бактерии — в красный.
На нефиксированный мазок наливают 0,5 % раствор соляной кислоты и подогревают над огнем 1 — 2 мин. С препарата сливают кислоту, тщательно промывают проточной водой, высушивают и после высыхания фиксируют на пламени. Фиксированный препарат окрашивают по методу Циля — Нильсена.
Результат: тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры — в красный.
Нефиксированный мазок обрабатывают 10 % формалином 10 мин, промывают проточной водой и высушивают. Окрашивают 3 мин аммиачным метиленовым синим (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего + 3 мл 98 % раствора аммиака + 80 мл дистиллированной воды), нагревая стекло над огнем до закипания красителя. Промывают проточной водой, докрашивают 0,5 % раствором сафранина 3—5 мин, промывают водой, высушивают и изучают при масляной иммерсии.
Результат: бактерии красные, споры синие.
1. Тонкие мазки фиксируют над пламенем (3 раза).
2. Окрашивают в предварительно профильтрованной смеси, состоящей из 0,5 г основного фуксина (насыщенного), 3,6 мл 0,1 М гидроортофосфата натрия, 1,4 мл 0,1 М дигидроортофосфата натрия и 55 мл дистиллированной воды (рН 7,2) 5 мин.
3. Окунают на 5 с в 0,5 % водный раствор лимонной кислоты.
4. Тщательно промывают в водопроводной воде.
5. Докрашивают 0,1 % водным раствором метиленового синего 1—2 мин или 1% раствором 10 с.
6. Ополаскивают в воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат: риккетсий окрашиваются в красный цвет, клетки и бактерии — в синий различных оттенков.
Часто используют также красящую смесь Гимзы. Ею можно окрашивать при рН 7,2-7,4, а затем дифференцировать в подкисленной воде до тех пор, пока эритроциты не станут розовыми, или при рН 6,5-6,0 с последующим промыванием и высушиванием мазков.
Материал фиксируют 10 % нейтральным формалином, заливают в парафин, депарафинированные срезы доводят до воды.
1. Окрашивают водным раствором метилового фиолетового (1:10 000) 30-60 мин.
2. Дифференцируют в слабой уксусной кислоте (две капли ледяной уксусной кислоты на 100 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока цитоплазма не обесцветится.
3. Докрашивают водным раствором метилового желтого (1:10 000) несколько секунд.
4. Обезвоживают и просветляют в ацетоне и ксилоле.
5. Заключают в синтетическую смолу.
Результат: риккетсий пурпурно-фиолетовые, ядра клеток желтые.
Лучше всего они выявляются в мазках из зева. Мазки фиксируют над пламенем горелки и окрашивают либо щелочным метиленовым синим Леффлера, либо ацетатом толуидинового синего, либо ацетатом кристаллического или метилового фиолетового. Коринебактерия грамотрицательна, ложнодифтерийные палочки при окраске по Граму обладают гораздо большей устойчивостью, чем возбудители дифтерии.
Возбудитель идентифицируют по характерным структурным особенностям: палочки имеют колбообразные вздутия на концах, что придает бактерии вид, булавы. В мазке наряду с длинными, тонкими, прямыми и слегка изогнутыми палочками можно обнаружить короткие и толстые. Характерным признаком бактерий дифтерии являются включения зерен волютина, находящихся на концах палочки. Ложнодифтерийные палочки значительно грубее, короче возбудителей дифтерии и не содержат зерен волютина. Зерна волютина окрашивают 10—15 с смесью, в состав которой входят 0,1 мл метиленового синего, 0,2 мл 96 % спирта, 5 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. После окрашивания мазки ополаскивают водой, докрашивают 10—15 с в 0,2 % водном растворе основного коричневого; снова ополаскивают водой, высушивают и изучают при иммерсии.
Бактериоскопическая идентификация, возбудителя дифтерии является ориентировочной, поэтому требуется подтверждение с помощью классического бактериологического метода. Более быстрым и достаточно специфичным методом идентификации дифтерийной палочки является непрямая иммунофлюоресценция с препаратом антител против О- и К-антигенов коринебактерий дифтерии. Кроме того, разработана иммуноферментная тест-система для выявления дифтерийного токсина, которая пригодна для определения токсинообразующих коринебактерий в мазках. .
В мазках гноя и осадка жидкости, полученной при лаваже бронхов, в ткани эндокарда, взятой при биопсии или на вскрытии, стрептококки выявляются при окраске по Граму: они грамположительны. Однако более ярко стрептококки окрашиваются анилиновыми красителями — синькой Леффлера и др. Характерна расположение стрептококков в виде цепочек, при этом делящиеся формы лежат перпендикулярно оси цепочки, что позволяет довольно точно идентифицировать эти микроорганизмы в мазках и срезах.
Так же как и стрептококки, стафилококки являются грамположительными микроорганизмами, но прекрасно воспринимают анилиновые красители типа метиленового синего, синьки Леффлера и др. Характер микроколоний стафилококков в тканях и выделениях морфологически хорошо идентифицируется это округлые образования со значительным количеством делящихся форм в виде тетрад.
В мазках цереброспинальной жидкости, мазках осадка промывных вод, в легочной ткани, полученной на вскрытии можно выявить грамположительные диплококки, располагающиеся цепочкой, или одиночные, покрытые капсулой. Эти микроорганизмы хорошо окрашиваются по Граму или анилиновыми красителями типа метиленового синего, в срезах — с большим трудом. В связи с наличием капсулы требуется специальное окрашивание.
Менингококки, представляющие собой диплококки без капсулы, грамотрицательны. Их выявляют в мазках цереброспинальной жидкости, нейтрофилах крови и свободно в крови, гное с оболочек мозга. Менингококки хорошо окрашиваются анилиновыми красителями типа метиленового синего. Мазки клинического материала нужно исследовать либо сразу, либо фиксировать и затем окрашивать спустя любое время. Для идентификации менингококков применяют также метод иммунофлюоресценции, но для этого необходимо наличие иммуноферментной тест-системы.
Гонококки, имеющие вид диплококка с капсулой, грамотрицательные, окрашиваются метиленовым синим по Леффлеру. В срезах гонококки окрашиваются с трудом. Эти микроорганизмы можно идентифицировать с помощью коммерческих иммунофлюоресцентных наборов.
Возбудитель чумы грамотрицателен. В. мазках патологического, материала он имеет характерный вид палочек оксидной формы, концы которых окрашиваются метиленовым синим более интенсивно, чем середина. Палочки часто собраны в цепочки. Созданы коммерческие иммунофлюоресцирующие препараты для идентификации возбудителей чумы и иммуноферментные тёст-системы на чумные антигены» пригодные для идентификации возбудителя в мазках и тканях.
Клостридии — крупные грамположительные палочки, все они могут образовывать споры. У возбудителя столбняка спора располагается на конце палочки, что придает ему вид барабанной палочки. Иногда споры могут находиться в центре клетки. У большинства видов есть перитрихиальные жгутики. Окрашивают клостридии карбол-фуксином либо по методу Ожешки для выявления спор.
Возбудители ботулизма (Cl. botulinum). Их выявляют с помощью биологической пробы на присутствие ботулинического токсина. Бактериоскопию не проводят.
Возбудители газовой гангрены (Cl. perfringens) и другие клостридии. При окраске мазков гнойного отделяемого из ран по Граму выявляют крупные грамположительные палочки, окруженные капсулой. Для окрашивания капсул на стекло наносят каплю туши и рядом петлей размазывают исследуемый материал. Смесь материала и туши тщательно перемешивают, делают тонкий мазок, высушивают, фиксируют любым способом. После фиксации мазок промывают протонной водой, окрашивают карболфуксином Циля, разведенным в соотношении 1:3, в течение 3 — 5 мин, промывают водой, высушивают и изучают при иммерсии. Выявление грубых или полиморфных палочек, имеющих капсулу, позволяет заподозрить наличие в исследуемом материале возбудителя газовой гангрены.
Мазки из мокроты при подозрении на легочную форму сибирской язвы, мазки из содержимого карбункула (при кожной форме) или мазки из кала, фиксированные любым способом, окрашивают по Граму. Окраску капсул проводят так же как при выявлении возбудителей газовой гангрены. Обнаружение крупных грубых грамположительных палочек, имеющих капсулу и расположенных в виде коротких цепочек, является основанием для установления предварительного диагноза сибирской язвы.
Возбудители кишечных инфекций относятся к нескольким семействам, все представители которых являются грамотрицательными, неспорообразующими палочками, имеют сходную морфологию и с трудом различаются бактериоскопически, поэтому они хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Идентификацию этих возбудителей лучше всего проводить иммуноцитохимически либо с помощью иммунолюминесцентного или иммуноферментного метода. Холерные вибрионы выявляют как с помощью анилиновых красителей типа метиленового синего, так и иммунолюминесцентным способом с препаратами люминесцирующих антихолерных антител.
Для выявления возбудителя сифилиса (Treponema pallidum) используют темное поле или иммунофлюоресцентную окраску. Они плохо окрашиваются анилиновыми красителями, но импрегнируются по методу Левадити в тканях.
Возбудители возвратного тифа (Borrelia recurrentis) хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красителями, а также по методу Гимзы и Райта. Фуксином они окрашиваются в розовый, краской Гимзы — в фиолетово-розовый цвет.
Лептоспиры плохо окрашиваются анилиновыми красителями, поэтому их обычно выявляют в бактериологических лабораториях с помощью живых возбудителей в темном поле — в толстой капле крови или в экссудатах из паренхиматозных органов.
Список литературы:
1. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: учеб. пособие. / Л. Б. Борисов, Б. Н. Козьмин-Соколов, И. С. Фрейдлин. - М.: Медицина, 1993. – 240 с.
2. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / под. ред. Л. Б. Борисова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. – 736 с.
3. Микробиология и иммунология / под ред. А. А. Воробьёва. - М.: Медицина, 1999. – 464 с.
4. Препараты для специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний : учебно-методическое пособие для врачей и студентов / И. И. Долгушин, О. Л. Колесников, М. С. Бельский, А. А. Колесникова. - Челябинск, 1999. – 50 с.
5. Поздеев О. К. Медицинская микробиология : учебник для вузов / под ред. В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – 768 с.
6. Асептика и антисептика: учебное пособие для студентов медицинских вузов/ Привалов В.А., Катунькина Т.В. – Челябинск: ЧелГМА, 2004. – 104 с
7. Сайт ЛабоRUтория" (www.primer.ru), 2003