Автор: Пользователь скрыл имя, 08 Апреля 2012 в 08:52, реферат
Нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается различного рода экссудатов, мазков из различных органов и тканей. Мазки готовят различно. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят каплю его на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного); если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки.
1. Введение
2. Методы окраски микробов
3. Простые методы окраски
3.1.Окраска основным фуксином по Пфейферу
3.2 Окраска метиленовым синим Лефлера
3.3 Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
4. Сложные методы окраски микробов
4.1.Окраска по Граму
4.2.Окраска карболовым тионином Николя
4.3 Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
4.4. Окраска по Романовскому-Гимзе
4.4.1. Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза….
5. Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)
6. Выявление жгутиков и ресничек
7. Выявление капсул бактерий
8. Выявление спор бактерий
9. Выявление возбудителей сыпного тифа и других риккетсий
10. Выявление коринебактерий дифтерии
11. Выявление анаэробных спорообразующих бактерий группы клостридии
12. Список литературы
7. Дифференцируют 4 мин в ацетатном буфере (рН 3,8).
8. Протирают концы предметных стекол, а затем осторожно удаляют избыток буферного раствора фильтровальной бумагой.
9. Заключают под покровное стекло в буферный раствор и оставляют на 2 мин. Препарат исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа сразу либо, если мазок оставляют надолго, держат в темноте и парафинируют края покровного стекла. Флюоресценция сохраняется в течение 3 мес.
Результат: бактерии, дрожжи, грибы рода Candida окрашиваются в красный цвет, паразиты — в красный с желтыми ядрами; лейкоциты — ярко-зеленые.
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.
2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.
Фиксация и методика окраски те же, что и для мазков крови. Для исследования на присутствие плазмоидиев, кроме мазков, берут обязательно и так называемую «толстую каплю». Последняя представляет собой каплю крови, размазанную по предметному стеклу углом другого стекла. «Толстую каплю» перед окраской не фиксируют.
1. На высохшую каплю наливают краску Романовского-Гимза, разведенную как обычно. Продолжительность окрашивания 30-50 минут.
Вариант: нефиксированную толстую каплю сушат в течение 1 ч на воздухе и окрашивают 2—10 мин смесью из 4 мл раствора Гимзы, 3 мл ацетона, 2 мл буферного раствора (рН 6,5) и 31 мл дистиллированной воды.
2. Осторожно споласкивают в дистиллированной воде и затем просушивают в вертикальном положении (фильтровальную бумагу применять нельзя).
Препарат исследуют при иммерсии. Для сохранения препаратов можно закрыть толстую каплю покровным стеклом, которое кладут на водный раствор поливинилового спирта или раствор желатина.
Ввиду того, что гемоглобин в водных растворах краски выщелачивается, эритроциты в окрашенной капле не видны. Морфология паразита в толстой капле менее ясна, чем в мазке.
Результат. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, отчетливо видна голубая протоплазма паразитов с ядром, окрашенным в розовый или красный цвет. Форма паразитов в зависимости от стадии развития может быть различной. В зрелых плазмодиях определяются темно-коричневые пигментные включения. Паразиты находятся в эритроцитах, но могут располагаться и свободно.
Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод Циля-Нильсена.
Для приготовления раствора карболового фуксина 1 г основного фуксина растворяют в 2 мл глицерина и доливают до 100 мл 5 % раствором фенола. Р. Лилли (1969) рекомендует следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.
1. Наливают на фиксированный мазок карбол-фуксин Циля (окрашивают через фильтровальную бумагу) и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживают в течение 1—2 минуты, не доводя до кипения.
2. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и основательно промывают в водопроводной воде.
3. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (на 70° спирте) до тех пор, пока мазок не примет бледно-розовый или бледно-фиолетовый тон (примерно 30—60 секунд).
4. Промывают в воде 15-30 и более секунд.
5. Докрашивают метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд.
6. Основательно споласкивают в воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Мазки, перекрашенные метиленовым синим, можно дифференцировать 70° спиртом.
Такое простое окрашивание мазков на микобактерии туберкулеза практически имеет наибольшее значение. Наряду с ним, но значительно реже, применяются и другие способы: метод обогащения, посевы, прививки животным.
Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне.
Окрашивают мазок с нагреванием на пламени горелки раствором фуксина иди генцианового фиолетового на анилиновой воде и затем обесцвечивают 1 —2 мин смесью (50 мл спирта + 20 мл 15 % азотной кислоты + 30 мл воды). В этой смеси растворяют до насыщения метиленовый синий или основной коричневый. Затем мазок промывают в проточной воде, сушат и изучают при иммерсии.
Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет (при окраске фуксином) или в фиолетовый (при окраске генциановым фиолетовым).
Фиксированные нагреванием мазки окрашивают в течение 8 — 10 мин при комнатной температуре в растворе аурамина (1 г аурамина в 100 мл 5 % фенола). Тщательно промывают проточной водой, дифференцируют в 2 сменах 2 % солянокислого спирта по 2 мин. Затем снова хорошо промывают в проточной воде, обрабатывают 0,1 % раствором перманганата натрия 20 с, снова промывают в воде, сушат и исследуют при иммерсии (2 мл концентрированной соляной кислоты на 98 мл спирта).
Результат: микобактерий имеют вид ярко-жёлтых палочек.
1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают любым карбол-фуксином при 70 °С 10 мин, при 55 °С - 30 мин, при 37 °С - 2 мин или при 20-25 °С 4-16 мин.
3. Промывают в воде.
4. Обесцвечивают в смеси 2 мл концентрированной соляной кислоты и 98 мл 95 — 70 % спирта от 20 с до нескольких минут (до обесцвечивания).
5. Докрашивают кислым квасцовым гематоксилином 2 —5 мин или 1 % раствором метиленового синего либо януса зеленого В в 1 % уксусной кислоте и 20 % спирте 3 мин (два последних красителя пригодны и для мазков).
6. Промывают в проточной воде.
7. Обезвоживают, просветляют (не следует пользоваться карбол-ксилолом, который обесцвечивает почти все микобактерии) и заключают в полистирол, капрат целлюлозы или депекс, но не в бальзам.
Результат: кислотоустойчивые микробы и цероид окрашиваются в красный цвет, ядра клеток — в синий или зелёный, гранулы лаброцитов (тучных клеток) при окрашивании метиленовым синим приобретают синё-фиолетовый цвет, но не окрашиваются гематоксилином. В материале, фиксированном формалином, эритроциты часто окрашиваются в розовый цвет, а стержни волос и кератогиалин — в красный различных оттенков.
1. Депарафинированные срезы доводят до воды и окрашивают 30 — 60 мин при комнатной температуре смесью, в состав которой входят 5 г фенола, 10 мл этилового или метилового спирта и 1 г основного фуксина (растворить и долить до 100 мл дистиллированной воды).
2. Переносят срезы в концентрированный раствор формалина на 5 мин.
3. Диференцируют почти до полного обесцвечивания в 2- % солянокислом спирте.
4. Переносят в концентрированный раствор формалина на несколько секунд и промывают в воде.
5. Докрашивают пикрофуксином Ван-Гизона и гематоксилином 10—15 мин, промывают в воде.
6. Дифференцируют и просветляют в спиртах возрастающей концентрации (от 95 % до 100 %), спирт-ксилоле и двух сменах ксилола, заключают в полистирол или пермаунт.
Результат: кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.
1. Мазки, фиксированные нагреванием (или в парах формалина, спирте, формоловых смесях, жидкости Карнуа), ополаскивают в воде.
2. Нагревают 10 мин в растворе Люголя до появления паров, просветляют 2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия.
3. Ополаскивают дистиллированной водой 30 с.
4. Нагревают до появления паров в растворе аммиачного серебра 30 с.
5. Промывают в дистиллированной воде, высушивают и заключают в бальзам.
1. Мазок кладут на 0,5—1 мин в слегка нагретую протраву (100 мл 12 % водного раствора танина + 50 мл насыщенного на холоде раствора сульфата железа + 50 мл спиртового раствора фуксина).
2. Хорошо промывают мазок водой и ополаскивают в спирте.
3. Окрашивают насыщенным раствором фуксина в анилиновой воде, к которому по каплям добавляют 1 % гидроксида нутрия до тех пор, пока раствор не станет мутным и не начнет выпадать, осадок красителя. Раствор красителя наливают на часовое стекло, мазок пускают плавать, подогревая краситель на спиртовке до появления паров. Окрашивают в течение 1—2 мин.
4. Промывают в воде, сушат и исследуют при иммерсии или заключают в бальзам.
Смешивают равные объемы 1,5 % хлорида натрия, 3 % таниновой кислоты и 0,9 г парарозанилина ацетата + 0,3 г парарозанилина гидрохлорида + 100 мл 96 % спирта. Хорошо размешивают, рН смеси должен быть от 4,8 до 5,2. При комнатной температуре краску можно хранить несколько дней, при 4 °С - до 2 мес., а при минус 10 °С — неопределенно долго.
Мазки с культур или из жидкостей не фиксируют на огне, можно пользоваться другими методами фиксации.
1. На мазок наливают светлую надосадочную жидкость красителя.
2. Окрашивают 8—15 мин до появления на стекле металлического оттенка.
3. Промывают в воде, высушивают и изучают при иммерсии.
Результат: бактерии и жгутики — красные.
Мазки окрашивают разбавленным в 10 раз насыщенным спиртовым раствором метиленового синего, подогревая краску на огне до кипения. Затем промывают в воде и окрашивают в течение 5 с 10 % спиртовым раствором фуксина, разбавленным водой в 10 раз. Промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в синий цвету а их капсулы — в красный.
Фиксированные над огнем мазки окрашивают при подогревании до появления паров в течение 2 мин 20 % водным раствором генцианового фиолетового. Затем промывают в воде и окунают на 8—10 с в 2 % раствор уксусной кислоты. Далее снова промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.
Результат: бактерии темно-синие, капсулы светло-синие.
Депарафинированные срезы окрашивают в течение нескольких часов смесью 5 частей насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового, 10 частей дистиллированной воды и 1 части ледяной уксусной кислоты (срезы можно оставить на ночь). Дифференцируют окраску 10—15 с 0,1 % растворе уксусной кислоты. Промывают срез водой, быстро обезвоживают в спиртах, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Результат: бактерии темно-синие, капсулы светло-синие.
На конец предметного стекла наносят каплю туши и петлёй — исследуемый материал. Смесь тщательно перемешивают петлей, делают мазок и высушивают его, не фиксируя. Исследуют при масляной иммерсии.
Результат: фон препарата окрашен в дымчато-темный цвет, на котором хорошо видны бесцветные микробные тела и их капсулы.
Негативно окрашенный препарат, приготовленный по методу Бурри, фиксируют любым способом, промывают водой и окрашивают карболовым фуксином, разведенным в соотношении 1:3. Промывают водой, высушивают и изучают при иммерсии.
Окрашивание спор удается только в мазках.
1. Мазки окрашивают в растворе карболового фуксина или фуксина на анилиновой воде в термостате при 37 °С в закрытой посуде в течение нескольких часов.
2. Обесцвечивают 2,5 % раствором серной кислоты в течение 3 — 5 с и споласкивают 96 % спиртом, пока не перестанут отходить облачка красителя.
3. Докрашивают метиленовым синим 3 — 5 мин.
4. Ополаскивают в проточной воде, сушат на воздухе и изучают при масляной иммерсии.
Можно окрашивать карболовым фуксином, подогревая на огне мазок с красителем до появления паров 5 — 8 мин, но тогда дифференцировать следует 2,5 % серной кислотой в течение 10-20 сек.