Автор: Пользователь скрыл имя, 08 Апреля 2012 в 08:52, реферат
Нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается различного рода экссудатов, мазков из различных органов и тканей. Мазки готовят различно. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят каплю его на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного); если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки.
1. Введение
2. Методы окраски микробов
3. Простые методы окраски
3.1.Окраска основным фуксином по Пфейферу
3.2 Окраска метиленовым синим Лефлера
3.3 Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
4. Сложные методы окраски микробов
4.1.Окраска по Граму
4.2.Окраска карболовым тионином Николя
4.3 Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
4.4. Окраска по Романовскому-Гимзе
4.4.1. Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза….
5. Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)
6. Выявление жгутиков и ресничек
7. Выявление капсул бактерий
8. Выявление спор бактерий
9. Выявление возбудителей сыпного тифа и других риккетсий
10. Выявление коринебактерий дифтерии
11. Выявление анаэробных спорообразующих бактерий группы клостридии
12. Список литературы
Министерство Образования и Науки РК. Костанайский государственный университет имени А. Байтурсынова.
Кафедра ветеринарной санитарии
Реферат на тему:
"Бактериальные краски ."
Подготовила:Тунева М. Вет.сан.15гр.
Костанай 2009 г.
4.1.Окраска по Граму
4.2.Окраска карболовым тионином Николя
4.3 Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
Нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается различного рода экссудатов, мазков из различных органов и тканей. Мазки готовят различно. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят каплю его на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного); если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки. Наконец, можно готовить мазки-отпечатки, для чего чистое предметное стекло прикладывают непосредственно к серозному покрову, слизистой оболочке или к свежей поверхности разреза какого-либо органа (ткани). При наличии жидкого содержимого (экссудат, моча и пр.) рекомендуется центрифугировать и из осадка готовить мазки.
Полученные по одному из вышеуказанных способов мазки тщательно высушивают и затем фиксируют сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно до 70°С) предметного стекла, которое для этого трижды проводят над пламенем спиртовки мазком вверх. Можно фиксировать мазки и в 96°спирте (10—15 минут).
Фиксированные мазки сохраняются в течение какого угодно времени.
Окрашенные мазки исследуют в масле, с иммерсионным объективом; при желании заключают в бальзам, в таком случае на окрашенный и хорошо высушенный мазок кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
В настоящее время классическую бактериоскопию с окрашиванием микробов различными красителями дополняют получившие широкое распространение иммуноцитохимические методы с применением меченых антител. Во многих случаях (особенно если применяют моноклональные антитела против поверхностных антигенов возбудителя) они позволяют провести высокоспецифичный экспресс-анализ.
Нередко наиболее доступными для исследования с целью идентификации возбудителя являются обработанные в центрифуге экссудаты, выделения, а также - кровь, пунктаты паренхиматозных органов, мазки и отпечатки тканей.
В лабораторной технике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Простым методом окраски называют окраску препарата одной какой-либо краской. К таким методам относится окраска разведенным фуксином или щелочной метиленовой синью.
При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами красителей. Сложные методы основаны на физико-химическом строении бактериальной клетки и сродстве микробов к определенным краскам. Эти методы окраски имеют весьма важное значение при дифференциации микробов. К сложным методам относится окраска по Граму, Цилю—Нильсену, Нейссеру и т. д.
1. Методы выявления кислых гликозаминогликанов (ГАГ) с помощью ШИК-реакции. Наилучшие результаты получают при выявлении простейших, в частности пневмоцист и токсоплазм, микоплазм, хламидий, некоторых грибов (особенно рода Candida) и капсулообразующих бактерий.
2. Методы с использованием основного фуксина, азура, тионина и метиленового синего (окраски по Пфейферу, Леффлеру, Николя и др.), которые в небольших концентрациях позволяют выявить разную, в основном бактериальную флору- Наиболее эффективны способы окраски по Цилю-Нильсену для выявления спирто- и кислотоустойчивых бактерий, в частности семейства Mycobacteriaceae (микобактерий туберкулеза, лепры и др.) и некоторых простейших (криптоспоридий). Используемые при этом основной фуксин и метиленовый синий позволяют выявить, помимо бактериальной флоры, фуксинофильные внутриклеточные включения, характерные для некоторых вирусных, особенно респираторных, инфекций. Азур и эозин эффективны для выявления различной бактериальной микрофлоры, особенно грамположительной, и некоторых простейших, в частности плазмодия малярии.
3. Методы, основанные на использовании анилинового фиолетового (окраска по Граму и ее модификации), позволяющие выявлять грамположительные бактерии и некоторые грибы, в первую очередь рода Candida. Следует, однако, иметь в виду, что наиболее интенсивно окрашиваются молодые формы. Погибшие или погибающие микроорганизмы утрачивают способность окрашиваться этими методами. В то же время часть грамотрицательных возбудителей, по крайней мере эшерихий, в случае их гибели становятся грамположительными или окрашиваются полихромно.
4. Методы, основанные на импрегнации нитратом серебра кусочков тканей, срезов или мазков, направлены на выявление разной, в основном бактериальной, флоры, поиски которой облегчаются в связи с тем, что импрегнированные серебром микроорганизмы немного увеличиваются в размерах.
Говоря о гистологических срезах, следует отметить, что некоторые микроорганизмы, особенно ДНК-вирусы (семейств Herpesviridae и Adenoviridae) и многие грибы (классов Ascomycetes и Phycomycetes), вполне удовлетворительно окрашиваются гематоксилином. В этом случае использование дополнительных способов окраски из числа перечисленных излишне. Осторожно следует подходить к интерпретации находок при бактериоскопии секционного материала, особенно при поздних вскрытиях, поскольку происходит постмортальная инвазия, а размножение многих видов бактерий происходит даже в предагональном периоде
Простые методы окраски микробов.
Окраска основным фуксином по Пфейферу. 1 г основного фуксина растворяют в 10—15 мл этилового спирта и смешивают со 100 мл 5 % раствора фенола. Затем 3 капли полученного раствора добавляют к 10 мл дистиллированной, воды и этой смесью окрашивают мазки в течение 30 — 40 мин. После этого ополаскивают водой, дифференцируют 0,1 % раствором соляной кислоты в абсолютном спирте, ополаскивают в абсолютном спирте и заключают в бальзам.
Результат: бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.
Метиленовый синий (N,N,N`,N'-тетраметилтионина хлорид тригидрат, 3,7-
Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 — 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго.
Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.
Для ориентировочной окраски бактерий можно воспользоваться также карболовым генциановым фиолетовым или кристаллическим фиолетовым. Однако эти красители при дифференцировке 700 спиртом легче извлекаются из клеточных элементов и бактерий, чем фуксин, поэтому, пользуясь ими, рекомендуется сильно перекрашивать.
Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового (генцианвиолет) со 100 мл 2,5 % раствора фенола (смесь хранится долго). Мазки окрашивают в течение 2 — 5 мин через фильтровальную бумагу, промывают в проточной воде, сушат и исследуют при масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.
Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.
1) 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта;
2) 10 г генцианового фиолетового +100 мл спирта;
3) 10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;
4) 1 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового + 10 мл дистиллированной воды;
5) 0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового +100 мл 5 % раствора уксусной кислоты;
6) 8 - 9 г метиленового синего +100 мл спирта;
7) 30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидроксида калия + 99 мл дистиллированной воды.
1) 8 — 9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;
2) 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина + 10 мл дистиллированной воды;
3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной воды;
4) 0,2 — 0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25 % раствор сафранина в 10 % спирте.
1. Мазки крови, цереброспинальной жидкости, экссудатов фиксируют над пламенем горелки (быстро проводят 3 раза над пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-800С в течение 3-4 с), затем высушивают. Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.
2. Наливают на фиксированный мазок карболовый или анилиновый генциановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2—3 минуты. Во избежании осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2—3 мин.).
3. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15—30 секунд).
4. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя иди другим йодистым раствором, например по Граму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл, а по Вейгерту до 100 мл дистиллированной воды).
5. Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).
6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.
Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.
7. Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1 — 2 мин.
8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля — 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).
9. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.
Результат: Грамположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма — розовая.
Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.
Смешивают 1 часть насыщенного спиртового раствора тионина с 10 частями 1 % водного раствора фенола, мазки окрашивают 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 30 секунд в 96 % спирте, снова ополаскивают в воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.
1. Мазки фиксируют в смеси равных частей диэтилового эфира и 95 % этилового спирта в течение 1ч.
2. Проводят через спирты нисходящей концентрации (80 %, 70 %, 50 %) и дистиллированную воду, окуная мазок по 5 раз в каждую порцию.
3. Окунают 4 раза в 1 % уксусную кислоту.
4. Переносят в дистиллированную воду на 2 мин.
5. Помещают на 3 мин в ацетатный буфер (рН 3,8).
6. Переносят в 0,01 % забуференный раствор акридинового оранжевого на 3 мин.