Скрининг лекарств

    С наступлением постгеномной эры, определение мишеней происходит с использованием методов сравнительной и функциональной геномики. На основании филогенетического анализа в геноме человека выявляют гены, родственные генам с уже известной функцией, и затем их выделяют (клонируют) для дальнейшего исследования. Кстати, такого рода предсказания уже удаётся довольно качественно формализовать, в результате чего подобные открытия уже под силу не учёным, а... роботам.

    Однако мишени, чьи функции определены лишь гипотетически, не могут служить отправной точкой для длительной и дорогостоящей разработки. Необходима тщательная экспериментальная валидация (проверка), в результате которой может быть понята конкретная биологическая функция мишени применительно к фенотипическим проявлениям исследуемой болезни. Существует множество методов экспериментальной валидации мишеней:

- Геномные методы позволяют подавлять синтез мишени в тестовой системе путем получения мутантов с генным нокаутом (в которых ген мишени попросту отсутствует) или использования РНК-антисмысловых последовательностей, «выключающих» тот или иной ген;

- Инактивация мишени с помощью моноклональных антител или низкомолекулярных лигандов-ингибиторов;

- Разрушение мишени, модифицированной хромофором, с помощью лазера;

 
    «Прямая» валидация мишени — установление её взаимодействия с тем или иным соединением (например, методом плазмонного резонанса).

Уровень надёжности валидации  повышается с числом модельных животных (специальных генетических линий  лабораторных животных), в которых  модификация мишени приводит к желаемому  фенотипическому проявлению. Высшим уровнем валидации является, несомненно, демонстрация того, что модификация  мишени (например, блокирование или  нокаут рецептора или ингибирование  фермента) приводит к клинически идентифицируемым и воспроизводимым симптомам  у человека. Однако по понятным причинам такое можно наблюдать достаточно редко.

    При выборе мишени не следует забывать о полиморфизме: любой ген может существовать в нескольких вариантах у разных популяций или рас людей, что может привести к разному эффекту лекарства на разных больных.

3. Поиск действующего вещества.

 Когда мишень уже найдена и её роль в развитии заболевания экспериментально подтверждена, начинаются исследования, непосредственным результатом которых являются многочисленные предсказанные структуры химических соединений — потенциальных прототипов лекарств, — лишь немногим из которых суждено стать «конечными» продуктами.

    Исследование всех возможных с химической точки зрения соединений («химическое пространство») невозможно: простая прикидка показывает, что возможно не менее 1040 различных лигандов. Поэтому на возможную структуру лигандов накладывается ряд ограничений, который существенно сужает химическое пространство (оставляя его, тем не менее, совершенно необъятным). В частности, для сужения химического пространства накладываются условия подобия лекарству (drug-likeness), которые в простом случае можно выразить «правилом пяти» Липинского, согласно которому соединение, чтобы «быть похожим» на лекарство, должно:

- Иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи;

- Обладать молекулярным весом менее 500;

- Иметь липофильность (logP — коэффициент распределения вещества на границе раздела вода-октанол) менее 5;

- Иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (грубая оценка количества акцепторов водородной связи).

    Если для «нашей» мишени известны природные агонисты, то один из наиболее очевидных путей — поиск их аналогов, превосходящих свои природные прототипы по требуемым качествам. Однако если такой «отправной точки» нет, или она по каким-то причинам не устраивает исследователей (например, пептиды имеют очень малое «время жизни» в организме, и чаще всего не подходят на роль лекарств), поступают иначе. В качестве стартового набора лигандов в этом случае обычно используют так называемые библиотеки соединений, либо поставляемые на коммерческой основе специализирующимися на этом компаниями, либо имеющиеся в арсенале фармацевтической компании, проводящей разработку нового лекарства. Такие библиотеки могут содержать тысячи и миллионы соединений. Этого, конечно, совершенно недостаточно для тестирования всех возможных вариантов, но этого, как правило, и не требуется. Основная задача на этом этапе — выявление соединений, проявляющих хотя бы небольшую активность требуемого свойства по отношению к мишени. Эти молекулы оптимизируют для увеличения сродства и/или селективности к мишени, и получают «кандидат» — соединение, предназначенное для тестирования на животных (доклинические исследования) и на людях (клинические исследования).

    Этап «просеивания» баз соединений осуществляется с помощью высокопроизводительного скрининга — экспериментального (in vitro — в лаборатории) или «виртуального» (in silico — на компьютере).

4. Высокопроизводительный скрининг.

    Скринингом (или сканированием) называется конвейеризованная процедура, в результате которой большое количество химических соединений (более 10000) проверяется на аффинность или активность по отношению к специальной тестовой системе, имитирующей биологическую.   По производительности различают разные виды скрининга:

- Низкопроизводительный (10000-50000 образцов); 
- Среднепроизводительный (50000-100000 образцов); 
- Высокопроизводительный (100000-5000000+ образцов).

    Для скрининга как для «промышленной» процедуры очень критична эффективность, стоимость и время, потраченное на операцию. Как правило, скрининг производится на роботизированных установках, способных работать в круглосуточном и круглогодичном режиме (см. рис. 2).

 
Рисунок 2. Аппаратура, используемая для высокопроизводительного скрининга.

    А. Роботизированная пипетка, в автоматическом высокопроизводительном режиме наносящая образцы тестируемых соединений в плашку с системой для скрининга. Типичное количество углублений на плашке — тысячи. Объем системы в одной лунке — микролитры. Объем вносимого образца — нанолитры.

    Б. Установка для высокопроизводительного скрининга и считывания флуоресцентного сигнала Mark II Scarina. Работает с плашками, содержащими 2048 углублений (NanoCarrier). Полностью автоматическая (работает в круглосуточном режиме). Производительность —100000+ лунок (образцов) в день.

    Принцип скрининга достаточно прост: в плашки, содержащие тестовую систему (например, иммобилизованная мишень или специальным образом модифицированные целые клетки), робот раскапывает из пипетки исследуемые вещества (или смесь веществ), следуя заданной программе. Причем на одной плашке могут находиться тысячи «лунок» с тестовой системой, и объем такой лунки может быть очень мал, так же как и объем вносимой пробы.

    Потом происходит считывание данных с плашки, говорящее о том, в какой лунке обнаружена биологическая активность, а в какой —  нет. В зависимости от используемой технологии детектор может считывать радиоактивный сигнал, флуоресценцию (если система построена с использованием флуоресцентных белков), биолюминесценцию (если используется люциферин-люциферазная система или ее аналоги), поляризацию излучения и многие другие параметры.

    Обычно в результате скрининга количество тестируемых соединений сокращается на 3—4 порядка. Соединения, для которых в процессе этого эксперимента выявлена активность выше заданного значения, называются прототипами. Однако следует понимать, что такие «удачи» еще очень и очень далеки от конечного лекарства. Лишь те из них, которые сохраняют свою активность в модельных системах и удовлетворяют целому ряду критериев, дают предшественников лекарств, которые используются для дальнейших исследований.

    Как уже было сказано, даже библиотеки, содержащие более миллиона соединений, не в состоянии представить все возможное химическое пространство лигандов. Поэтому при проведении скрининга можно выбрать две различные стратегии: диверсификационный или сфокусированный скрининг. Различие между ними заключается в составе используемых библиотек соединений: в диверсификационном варианте используют как можно более непохожие друг на друга лиганды с целью охватить как можно большую область химического пространства, при сфокусированном же, наоборот, используют библиотеки родственных соединений, полученных методами комбинаторной химии, что позволяет, зная «приблизительную» структуру лиганда, выбрать более оптимальный его вариант. Здравый смысл подсказывает, что в масштабном проекте по созданию нового лекарственного препарата следует проводить два этих этапа сканирования последовательно — сначала диверсификационный, с целью определения максимально различных классов удачных соединений, а потом — сфокусированный скрининг, с целью оптимизации структуры соединений и получения рабочих прототипов.

    Если для мишени известно так называемое биологическое пространство — то есть какие-либо характеристики связываемых ею лигандов (размер, гидрофобность и т. д.), — то при составлении библиотеки тестируемых соединений выбирают лиганды, попадающие в «пересечение» биологического и химического пространств, так как это позволяет отсеять заведомо бесперспективные соединения.

    Структуры прототипов, полученные в результате скрининга, подвергаются не одному раунду модификаций с целью удовлетворить разнообразным требованиям, налагаемым на реальное лекарственное вещество. Эта оптимизация происходит в тесном сотрудничестве между различными группами исследователей: молекулярными биологами, фармакологами, специалистами по компьютерному моделированию и медицинскими химиками ( см. рис. 3).