Витамины и белки

Белковые  вещества весьма чувствительны к  повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). Поэтому  обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и  др.), в данном случае неприемлемы. Белки  в этих условиях подвергаются денатурации, т. е. теряют некоторые существенные природные (нативные) свойства, в частности  растворимость, биологическую активность. Разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

Перед выделением белков из биологических  объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый  материал тщательно измельчают до гомогенного  состояния, т. е. подвергают дезинтеграции  вплоть до разрушения клеточной структуры.

Успешно применяется также метод попеременного  замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит  разрушение клеточной оболочки, вызванное  кристаллами льда. Для дезинтеграции  тканей используют также ультразвук, пресс-методы (замороженный биоматериал  пропускают через мельчайшие отверстия  стального пресса под высоким  давлением) и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем  резко сбрасывают давление - выделяющийся газообразный азот как бы «взрывает» клетки.

Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией  белков из гомогенатов тканей. Большинство  белков тканей хорошо растворимо в 8-10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные  буферные смеси с определенными  значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты - вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и  между белковыми молекулами.

Из  органических соединений, помимо давно  применяемых водных растворов глицерина, широко используют слабые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии  применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков.

Почти все органические растворители разрывают  белок-липидные связи, способствуя  лучшей экстракции белков.

Для получения из биологического материала  белков в чистом, гомогенном, состоянии  применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых связей Следует иметь в виду, что  детергенты, вызывая разрыв белок-белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру белков.

После достижения полной экстракции белков, т. е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению - фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого  применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение  органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией  каждой молекулы, что приводит к  образованию вокруг белковой глобулы  водных (гидратных) оболочек, состоящих  из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул  воды. Растворы белков отличаются крайней  неустойчивостью, и под действием  разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные  растворы нейтральных солей щелочных металлов) , а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение  и др. ) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение  в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей  щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности  растворяться вновь в воде после  удаления солей методами диализа  или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической  практике при анализе белков сыворотки  крови и других биологических  жидкостей, а также в препаративной  энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях  нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел  широкое применение в клинике  для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

На  величину высаливания белков оказывают  влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура.

В последнее время наибольшее распространение  получили хроматографические и электрофоретические  методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный  в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан  на способности пигментов (или любых  других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых  веществ и их концентрирование в  строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют  силы адсорбции и выносят с  током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами  и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке  белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография  по сродству) - в соответствии с разными  физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется  не только для выделения белков, но и для разделения множества  других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых  организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов  смеси (образца) основано на их различной  сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или  кремния.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной  твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной  хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых  в качестве стационарной фазы применяют  влажный крахмал или силикагель.

Разновидностью  распределительной хроматографии  является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических  лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот  и других веществ.

Ионообменная  хроматография. Ионообменные смолы  являются полимерными органическими  соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в  ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и  аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола  и целлюлозы. Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная  жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при  создании и определении лекарственных  веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах  и производствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных  количествах.

6. Литература:

http://revolution.allbest.ru/biology/00176753.html