Электрофорез. Метод разделения органических соединений

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

 

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат по дисциплине:

«Контроль качества кулинарной продукции и услуг общественного питания»

На тему:

«Электрофорез. Метод разделения органических соединений»

 

 

 

 

Выполнил: Минаева Д.Р.

Студентка 5 курса

Института ТПМ

Группы 10-Т-05

Спец. 260501.65

Принял: доц., к.т.н. Басов В.О.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Москва 2014 г.

Оглавление

 

1. Введение…………………………………………………………………...3
2. Сущность и принцип метода…….……………………………………….4
3. Применимость метода капиллярного электрофореза………………......7
4. Заключение……………………………………………………………......13
5. Список использованной литературы……………………………….…...14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Исследование любого пищевого продукта – сложная аналитическая задача. Из-за особенностей состава и многокомпонентности продуктов необходимо приспосабливать  стандартные методы к особенностям состава и физико-химической структуры продукта – т.е. в каждом конкретном случае требуется проведение в той или иной мере аналитической исследовательской работы.

Сегодня можно выделить следующие методы, нашедшие широкое применение в пищевой промышленности: газовая хроматография, жидкостная хроматография, атомно-абсорбционная спектрометрия, фотометрия, люминесценция, капиллярный электрофорез, инфракрасная спектроскопия, электрохимия, классические методы анализа (титриметрия, гравиметрия), реологические методы исследования.

В настоящее время отмечается увеличение доли хроматографических методов и капиллярного электрофореза, что указывает на первоочередную важность освоения данных методов для пищевой промышленности.

         В будущем  возрастет использование спектральных, атомно-абсорбционных методов и методов капиллярного электрофореза для проведения исследований качества сырья и готовой продукции. Из этого следует, что освоение методологией оценки свойств сырья и готовой продукции для инженеров-технологов имеет самое важное значение. [1]

 

 

 

 

 

 

Сущность и принцип метода.

 

Электрофорез - метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле называют электрофорезом (от “электро” и греческого phoresis — перенесение).

Электролиз относится к методам разделения без превращения веществ, на основе заряда частиц. По технике выполнения метод аналогичен хроматографии, поэтому и рассматривается в этой главе.

Рис 3.5.1. Схема прибора для электрофореза.

Нередко под электрофорезом понимают перемещение коллоидных частиц или макромолекул, в отличие от иовофореза - перемещения неорганических ионов малого размера.

Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля; величина электрического заряда; скорость и размер частицы; вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза.

Электрофорез можно проводить как в свободном растворе (фронтальный электрофорез), так и на носителях (зональный электрофорез). Последний вариант предпочтительнее, т.к. носители способствуют стабилизации электрофоретических зон. В качестве носителей используют: фильтровальную бумагу, силикагель, крахмал, оксид алюминия, поливинилхлорид, агаровый и полиакриламидный гели и др.

Электрофоретическое разделение осуществляют на бумаге, в тонком слое сорбента, колонке или в блоке (который часто формируют из суспензии крахмала в подходящем электролите). Аппаратура для электрофореза выполняется по единой схеме: источник тока, камера для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока и приспособление для сбора и идентификации разделенных веществ (последний блок в некоторых случаях отсутствует). Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов. На рис. 3.5.1 представлена схема прибора для электрофореза на бумаге. Электрофоретическая камера состоит из двух кювет, в которые помещают графитовые электроды и раствор проводящей жидкости (буферный раствор). Выше кювет находится подставка для носителя бумаги. Смесь веществ, подлежащих разделению, наносят на пропитанную проводящей жидкостью бумагу. Бумагу подсушивают, помещают на подставку, концы погружают в кюветы, затем камеру плотно закрывают крышкой. После пропитывания бумаги проводящей жидкостью подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают. Качественную и количественную оценку осуществляют, применяя методы, используемые в бумажной хроматографии, например, проявление белков с помощью красителей, количественную оценку - методом денситометрии.     Важной областью применения электрофореза является анализ белков сыворотки крови, аминокислот гидролизатов белков, нуклеиновых кислот и т.п. В кислотном буферном растворе аминокислота находится в виде катиона NHз+......COOH, который будет перемещаться к катоду, в то время как в щелочном буфере аминокислота превращается в анион NH2....COO-, и будет двигаться к аноду. В изоэлектрической точке аминокислота находится в растворе в виде биполярного иона NH3+......COO- и не будет передвигаться в электрическом поле.

 

 

Рис. 3.5.2. Электрофореграмма (а) и схемы (б) белковых фракций.

 A - белковые фракции сыров: 1, 17 – российского, 2, 16  - волжского, 3, 15 – “Орбита”, 4, 14 - колбасного, 5, 13 – голландского, 6, 12 – пошехонского, 7, 11 – “сырного” казеина после осаждения при pH 4,6, 8, 10 – молочной сыворотки, 9 – казеина по Гаммерстену, 18 – “городского”.

Б – белковые фракции сыра (I), сырного казеина (II) 

Ввиду того, что отдельные белки и аминокислоты имеют различные изоэлектрические точки, при определенном значении рН они будут двигаться с различной скоростью. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно использовать электрофорез для их разделения. Метод позволяет разделять вещества, различие в изоэлектрической точке которых составляет до 0,02 единиц рН. Градиент рН в 0,02 единицы часто достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминаполикарбоновых кислот.

Электрофоретическое разделение белков широко используется для оценки качества мяса и мясных продуктов, для дифференцирования вида мяса и рыбы. Метод также применяется для выявления немясных добавок (белков молока, сои, яиц) в мясных продуктах. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле можно охарактеризовать изменение белков в процессе созревания сыров (рис.3.5.2).

В настоящее время используют высокоэффективный капиллярный электрофорез, например, для анализа витаминов в диетических продуктах (жирорастворимых А, Е, К, Д; водорастворимых - B1, B2, B6, B12, С, никотинамида); и для определения анионов (сульфат - хлорид-, иодид-) в молочных продуктах.

Метод капиллярного электрофореза основан на принципе разделения компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (около 2 нл) вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером - электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ) компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее - от величины ионного радиуса), и соответственно в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной (после построения градуировочной зависимости) - высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. [2]

 

 

Применимость метода капиллярного электрофореза.

 

Метод капиллярного электрофореза с успехом применяется для анализа разнообразных веществ и объектов: катионов металлов, неорганических и органических анионов, аминокислот, витаминов, наркотиков, пигментов и красителей, белков, пептидов, анализа фармпрепаратов и пищевых продуктов. Также методы с успехом применяются для контроля качества вод и напитков, технологического контроля производства, входного контроля сырья, в криминалистике, медицине, биохимии, в том числе для цепей расшифровки генетического кода живых организмов и т.д.

 

 

Метод капиллярного электрофореза также используют для:

1. Определение содержания  анионов в питьевой воде (ГОСТ                             Р 52181-2003 ВОДА ПИТЬЕВАЯ. Определение содержания анионов методами ионной хроматографии и капиллярного электрофореза. [3]

2. Определения  массовой концентрации 2,4-дихлорфеноксиуксусной  кислоты (далее - 2,4-Д) в питьевой воде (ГОСТ Р 52730-2007 ВОДА ПИТЬЕВАЯ. Методы определения содержания 2,4-Д). [4]

3. Определение органических кислот  методом капиллярного электрофореза  в винодельческой продукции. (ГОСТ  Р 52841-2007   ПРОДУКЦИЯ ВИНОДЕЛЬЧЕСКАЯ. Определение органических кислот  методом капиллярного электрофореза). [5]

Рассмотрим один из предложенных ГОСТов.

ГОСТ Р 52841-2007   ПРОДУКЦИЯ ВИНОДЕЛЬЧЕСКАЯ. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКЦИЯ ВИНОДЕЛЬЧЕСКАЯ

Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза

Wine production.

Determination of organic acids by capillary electrophoresis method

Дата введения — 2009—01—01

 

 

1    Область применения

           Настоящий стандарт распространяется на винодельческую продукцию и устанавливает метод определения содержания органических кислот — винной, яблочной, янтарной, лимонной и молочной в диапазоне измерений с учетом разбавления от 0,001 до 0,050 г/дм3 на основе измерения их массовых концентраций посредством капиллярного электрофореза.

4    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

          Прибор (система) капиллярного электрофореза, оснащенный кварцевым капилляром длиной не менее 50 см до детектора, внутренним диаметром 75 мкм, фотометрическим детектором, работающим на длине волны 254 нм, или спектрофотометрическим детектором в интервале длин волн от 200 до 300 нм и электронно-вычислительной машиной (компьютером) с программным обеспечением для обработки электрофореграмм, например система капиллярного электрофореза «Капель» (НПФ Люмэкс).

          Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более + 0,0002 г.

Пипетки мерные 2-го класса точности по ГОСТ 29227.

Колбы мерные 2-го класса точности по ГОСТ 1770.

Пробирки одноразовые (типа Эппендорфа) вместимостью 1,5 см3.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Кислота винная с содержанием основного вещества не менее 99,0 %1.

Кислота яблочная с содержанием основного вещества не менее 99,0 %2.

Кислота янтарная с содержанием основного вещества не менее 99,0 %3.

Кислота лимонная с содержанием основного вещества не менее 99,0 %4.

Лактат лития с содержанием основного вещества не менее 95,0 %5.

Кислота дипиколиновая с содержанием основного вещества не менее 99,0 %6.

Тетраметилэтилендиамин с содержанием основного вещества не менее 99,5 %7.

Этилендиаминдиуксусная кислота с содержанием основного вещества не менее 99,0 %8.

6    Сущность метода

         Метод капиллярного электрофореза определения массовой концентрации органических кислот основан на миграции и разделении анионных форм анализируемых компонентов под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Для детектирования кислот используют косвенный метод, регистрируя поглощение в ультрафиолетовой области спектра при 254 или 270 нм.

9.2    Подготовка прибора и порядок проведения анализа

             Прибор подготавливают к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают следующие рабочие параметры:

-    длина волны спектрофотометрического детектора — 270 нм, фотометрического — 254 нм;

-    напряжение «минус 25 кВ»;

-    дозирование пробы — пневматическое при 30 мБар в течение 5 с при напряжении 0 кВ;

-    время анализа — 15 мин;

-    рекомендуется термостатирование капилляра при температуре 20 °С.

               Перед измерением подготавливают капилляр к работе, промывая его 3,5 %-ным раствором соляной кислоты (см. 9.1.2) в течение 3 мин, затем дистиллированной водой — 3 мин, затем 4 %-ным раствором гидроокиси натрия (см. 9.1.1) в течение 3 мин, затем дистиллированной водой в течение 3 мин и далее рабочим буферным раствором (см. 9.1.6) в течение 3 мин.

            Капилляр промывают каждый раз при включении прибора. Результаты первого измерения отбрасывают. Содержимое одной пробирки с рабочим буферным раствором можно использовать для выполнения не более пяти измерений.