Ферменттік препараттарды алу

   Продуцент ретінде БКСР ҒА-ның микробиология Институтында бөлініп алынған Trichoderma lignorum ОМ534 саңырауқұлағын қолдануға болады, ол құрамында целлюлоза бар табиғи субстраттарды ыдыратуға қажетті целлюлолитикалық ферменттердің  толық кешенін (С1, С2, Сх компоненттерді де қоса алғанда) алуға мүмкіндік береді. Егу материалы ретінде орта көлемінің 5% мөлшерінде енгізілетін 1-2 тәуліктік мицелий немесе споралар өлшендісі қолданылады. Ортаның құрамы келесідей: құбыр суымен 3есе сұйылтылған ашық түстендірілген сүт сарысуы, NaNO3-0.3%, (NH4)2SO4-0.06%, MgSO4*7H2O-0.05%.  Культивирлеудің  оптимальды температурасы 29˚С.

Кесте-2. Аэрация ортасының ферментатордағы целлюлазаның биосинтезіне әсері

2-ші кестеден көрінетіндей, целлюлаза синтезі ортаның бір көлеміне бір көлем ауа жіберген  кезде ең белсенді деңдейде жүреді(араластырғыштың айналу жиілігі 280 айн/мин).

  Ферментация ұзақтығы (культуралды сұйықтықтағы целлюлазалардың максимал белсенділігіне жету уақыты) 60-62 сағатты құрайды.

   Сүт сарысуы бар ортада T.lignorum целлюлазасы синтезінің өзіндік ерекшелігі культуралды сұйықтықта 36-54сағ интервалында ферменттердің белсенді жиналуі және келесі сағаттарда белсенділіктің өте тез төмендеуі болып табылады. Культуралды сұйықтықтағы целлюлоза жиналуының максимумы уақыт бойынша орта лактозасын максималды тұтынумен және 7,6-7,8 РН-пен сәйкес келеді. Бұл кезде ферменттің белсенділігі 3,0-3,С2 бірлік/мл; биомасса концентрациясы 10-12г/л, ақуыз мөлшері 1,1мг/мл және культуралды сұйықтықтағы редуцирлеуші қанттардың мөлшері 0,1% .

   Содан соң, бірнеше сағаттың ішінде (орташа 2-4) РН-тың 8,0-8,1-ге дейін жоғарылауы және целлюлаза белсенділігін 2есе бірден төмендеуі байқалады. Ферментацияның аяқталғанын  7,8РН және тығыз сары түсті мицелийдің сыртқы түрі мен түссіз культуралды сұйықтық бойынша білуге болады. РН-тың 8,0 және одан да жоғары көтерілуі мицелий автолизінің болжауымен және культуралды сұйықтықтың лайлануымен бірге өтеді. Ферментация аяқталған соң бірнеше сағатта культуралды сұйықтыұтағы целлюлазалардың белсенділігінің бірден төмендеп кетуі ортада сарысу ақуыздарының болуы есебінен түзілетін протеолитикалық ферменттердің әсерінен болатын сияқты.

  Культуралды сұйықтықтан целлюлазаларды тұндыруды ацетонмен, изопропанолмен және желатин қосылған танинмен іске асыруға болады. Ацетон, изопропонол мен этанолды пайдаланған кезде культуралды сұйықтықтың көлеміне тұндырғыштың үш көлемін қосу керек. Ортаның бастапқы рн 7,6-7,8, температурасы 10-15°С. Тұнбаны тұндырғышты қосқаннан кейін 20-30 минут өткен соң бөліп алады.

  Аммоний сульфатымен өңдеуді 80% қанығуда, ортаның бастапқы рн 7,8 және температурасы 10-15°С жағдайда жүргізу қажет. Тұнбаны 3000-4000 айн/мин кезінде 10-15 минут бойы центрифугирлеу арқылы бөледі. Ферменттік тұнбаны меофильді немесе вакуум астында, 10-12% қалдық ылғалдылыққа дейін 25-30°С температурада кептіреді.

Целлюлазаларды түрлі тұндырғыштармен бөлу нәтижелері 21- кесте

  Целлюлазаларды түрлі тұндырғыштармен бөлу нәтижелері 21- кестеде көрсетілген.Одан белсенділігі мен шығындылығы бойынша жоғарғы көрсеткіштерге сульфатпен және танинмен тұндырылған препараттар ие екені көрінеді. Бірақ сульфатпен тұндырылған препарт жоғарырақ меншікті белсенділікке ие, препараттың ең жақсы үлгілері келесі көрсеткіштерді көрсетті: с1 – 1000 бірлік/г, с2 – 800 бірлік/г, сх - 1000 бірлік/г (целлюлолитикалық ферменттердің белсенділігі Mandels, Weber бойынша бірліктерде берілген.

    Культуралды сұйықтықтан целлюлазаларды биомассамен бірге тұндырғанда препараттың шығымы орташа 10 есе өсті, бірақ белсенділігі төмендеді.

   Культуралды сұйықтықтан целлюлозаны бөліп алудың сульфат-изопропилді әдісін пайдалану жақсы нәтиже береді. Целлюлолитикалық ферменттерді бөлудің оптимальді жағдайлары келесідей: температура 4-150С, культуралды сұйықтықтың бастапқы рн-7-8, аммоний сульфатымен өңдеу ұзақтығы 12-16 сағат, изопропональды концентрациасы 10%. Бұл кезде ферменттің белсенділігі бойынша шығымы 75-80% құрайды, ал алынған ферменттік препараттың белсенділігі с1 – 1000, с2 – 1130 және сх – 3900 бірлік/г құрайды. Препараттың минимальды тұрақтылығын қамтамасыз ететін кептіру түрі салыстырмалы төмен температурадағы миофильді немесе вакуумдық кептіру болып табылады.

Ферменттерді бөліп алу және тазалау.

   Жасуша цитоплазмасында еріген ферменттер одан сумен немесе тұздардың сұйытылған ерітінділерімен оңай экстракцияланады. Содан кейін бұл ферменттерді аммоний сульфатымен фракционирлеу арқылы тазалайды және бір-бірінен бөліп алады.

   Жасушаның құрылымдық элементтерімен байланысқан ферменттерді дезинтеграциадан, яғни жасуша қабықшасын бұзудан кейін ғана бөліп алуға болады. Жасушаларды уатып, қатырып және қайтадан ерітіп, ультрадыбыстың әсеріне ұшырату арқылы механикалық жолмен және арнайы ферменттік препараттарды пайдаланып ферментативтік жолмен бұзуға болады.

   Жасушаларды бұзу үшін алдымен биомассаның құрамында қандайда бір буфер, этилендиаминтетра сірке қышқылы және альбумин болатын сахарозаның децимолярлы ерітіндісіне (рн-7,3) жуады. Содан сон шыны микрошарларды қосады да, 13000 айн/мин жиілікте дезинтеграторда гомогенизациялайды. Жасуша қабықшаларын және шыны микрошарларды центрифугалау арқылы бөліп алады.

   Егер фермент суда ерімейтін липопротеидті кешендердің құрамында болса, онда ферментті ерітінді көлемінің 3-6% мөлшеріндегі бутил ерітіндісінің көмегімен ерітіндіден липиттерді бөліп алады. Фермент сулы қабатта қалады, ал липиттер бутил спиртінің қабатына ауысады.

  Ферменттер ерітінділерін концентірлеуге ең алдымен балластық белоктардан құтылу арқылы қол жеткізіледі. Егер фермент  термотұрақты болса, мысалы рибонуклеаза, онда белоктардан ерітіндіні қыздыру арқылы құтылады. Кейде белоктарды қышқылдармен денатурациялау немесе ферменттік ерітіндіге хлороформмен немесе хлорофильмен спирттің қоспасымен томен температурада әсер ету арқылы жояды.

   Балластық белоктардың бір бөлігін жойған соң одан кейінгі ферменттерді концентірлеу үшін тұздар ерітінділерімен, мысалы аммоний сульфатымен фракционирлеуді пайдаланады.Бұл жағдайда Белсенсіз белоктар коагуляцияланатын, ал белсенді фермент ерітіндіде қосатын тұздар концентрациясын концентрациясын анықтау керек. Тұнбаны центрифугалау арқылы бөліп алады және насадкасы сұйықтықты лиофильдендіруден кейін ферменттік препарат алады.

  Белокатар коагуляциясы мен ферменттерді тазалау үшін сондай-ақ органикалық еріткіштер- ацетон, этил спирті, метил спирті, диоксан қолданылады.

  Ферменттік тазалаудың преспективті әдісі селективті немесе таңдамалы адсорбция болып табылады, мұнда ферменттік ерітіндіге аз мөлшерде каолин, кальций үшфосфаты, аммоний гидрототығы және де басқа адсорбенттер қосылады. Осылайша белсенді ферменттің немесе балластық белоктардың адсорбциясын жүзеге асырады. Бөлу центрифугалаумен бірге жүргізіледі. Адсорбенттен ферментті элюирлеу үшін фосфатты буфер ерітіндісін пайдаланады. Егер ферменттік ерітіндіде бейорганикалық тұздар көп болса, адсорбцияның алдында диализ немесе сефадекс арқылы ерітіндіні фильтрлеуді жүргізеді.

  Құрамында физико-химиялық қасиеттері бойынша ферментке ұқсас белоктар қоспасының біршама мөлшері болатындықтан, ферменттік препаратты ион алмастырғыш хромотография әдісімен тазалайды. Ион алмастырғыш процесінде белоктар ионитпен әрекеттеседі де, электро культуралды сұйықтықтан электростатикалық әсерлеудің көмегімен оның бетімен байланысады. Ионит бетінен белоктарды элюирлеу үшін буфер иониті арқылы өткізілетін рН кезінде концентрациясының өзгеруін немесе бейтарап тұздарды енгізуді (NaCl, KCl) қолданады.

  Соңғы уақытта ферменттерді бөлу үшін целлюлоза негізіндегі иониттерді кең пайдаланады.

  Белоктарды ақырғы фракционирлеу  үшін сондай- ақ электофорезді де қолданады,оның негізінде электр өрісінде белоктардың қышқыл және негізді молекулаларының зарядтары бойынша бөлінуі жатыр. Ерітіндіден жоғарғы дәрежеде тазаланған ферменттерді кристал түрінде де алуға болады. Ферменттер кристаллизация сын аммоний сульфаты , спирт немесе органикалық еріткіштер ерітінділерінен жүргізеді. Ферменттің концентрлі ерітіндісіне аздап, лайлап бастағанша, тамшылатып абайлап, аммоний сульфатф немесе спирттің қаныққан ерітіндісін қосады. Содан соң ерітіндіні суық жерге бірнеше күнге қояды. Алынған кристалдарды бөліп, фермент белсенділігінің өсуі тоқтағанша қайта крисаллизациялауды жүргізеді.

  Ашытқылардың биомассасы НАД  (никотинамидадениннуклеотид) коферментіне бай. Биохимиялық зертханаларда жұмыс істеуге қажет НАД препаратын нан пісіретін ашытқылардың экстрактынан алуға болады. Экстракцияны сумен (82-85%) аэросил А- 300 препаратының қатысында жүргізеді. Содан соң 25-300 С температураға дейін салқындатылған, рН 6,0-6,1 болатын фильтратты КУ- 23 (Н+ - форма) ион алмастырғыш шайырлар арқылы өткізеді. КАД-ты 0,005н тұз қышқылымен элюирлейді. Алынған элюатты АН-231 (Cl-  -форма) бар колонка арқылы тағы өткізіп, содан соң дистелденген сумен элюирлейді.  Ары қарай тазалау үшін алынған НАД ерітіндісін КУ- 23 (Н+ - форма) бар колонка арқылы өткізедіжәне тек 0,1н аммоний ацетатты буфер ерітіндісімен (рН 5,8-5,9) элюирлеген соң ғана құрамында 95-99% пиридиндік коферменттер бар ерітінді алады, оның 62-65% НАД белсенді коферменті құрайды. Мұндай өңдеу кезінде НАД шығымы 50-60% құрайды.

Ферменттердің және микроорганизмдердің тұтач жасушаларын иммобилизациялау

Ферменттер биологиялық объектілерде көбінесе түрлі жасушалық құрылымдардың- жиі мембраналардың (жарғақ) бетінде бекітілген күйде болады. Осының әсерінен ферменттер өздерінің белсенділігін ұзақ уақыт сақтайды. Технологияда ұзақ уақыт бойы бос ферментердің препараттары қолданылады; мұндай күйде оларды пайдалану ұзақтығы қысқа болады- тек бір өндірістік цикл. Молекулалық биология жетістіктері көптеген ферменттердің құрылысын нақтырақ зерттеуге мүмкіндік береді. Ферменттік белоктардың бірқатарының аминқышқылдық құрамы, олардың кеңістік конфиграциясы ашылады, белсенді орталықтары, ферменттік каталитикалық белсенділігінің байқауында түрлі функционалды топтардың алатын орны анықталды және т.б. Бұл пролонгирленген (ұзақ) әсерлі ферменттер өндірісі үшін теориялық база құрылған мүмкіндік берді,оларды кейде иммобилизацияланған, фиксацияланған немесе байланған ферменттік препараттар деп атайды. Ферменттер иммобилизациясының мәні- оларды белсенді формада ерімейтін негізгі бекіту немесе жартылай өткізгіш мембраналық жүйеге орналастыру. Ферментті  тасымалдағышқа бекіту адсорбциялық жолмен, химиялық байланыспен немесе ферментті органикалық немесе бейорганикалық гельге (капсулаға және т.б.) механикалық жалғау жолымен іске асырылады және бұл кезде ферментті тек оның белсенді орталығына кірмейтін және фермент- субстратты кешенінің түзілуіне қатыспайтын функционалды топтар арқылы ғана бекітуге ғана болады. Ферментті тасымалдаушы немесе матрицадәнді материал, талшықты құрылым, иілгіш бет, қабыршық немесе маталар, ортасы бос талшықтар, құбырлар, капсулалар және т.б түрлерінде бола алады. Тасымалдағыш бөлшектерінің өлшемдері маңызды рөл атқарады. Үлкен бетке ие болу керек, сондықтан диаметрі 0,1-0,2 мм бөлшектерді қолдану ұсынылады. Фермент тасымалдағышы табиғи зат та, синтетикалық полимерде бола алады. Иммобилизация үшін целлюлоза мен оның туындыларын- қышқыл карбоксиметилцеллюлозаны, ацетилцеллюлозаны және т.б кең қоданады. Целлюлоза суда ісінеді және оның гидроксильді топтары фермент молекуласының белгілі бөліктерін қосып алады.Синтетикалық тасымалдаушылардан полимерлі ион алмастырғыш шайырлар түріндегі карбоксилді немесе сульфоксильді  хлоридтерді, диазотталған полиаминостеринді, метакрил қышқылының  нитратты сополимерлерін атауға болады.

  Ферменттің иммобилизациялау процесін глюкоамилазаның ацетилэтилцеллюлозаның тасымалдағышымен байланысында көрсетуге болады. Тасымалдағашты ісіну үшін тәулік бойына дистелденген суға салып қояды. Содан соң ісінген ацетилцеллюлозаға араластыру қатысында алдымен рН 5,5 болатын натрийацетатты буфер, одан кейінгі тазаланған фермент ерітіндісін қояды; аралсатырған соң қоспаға көлденең тігуші агент-глутарлы альдегид қосады. Соңғысы тасымалдағыштың амин тобы мен ферменттік белоктың карбоксильді тобының арасында амидтік байланыс түзеді бірнеше сағаттан соң алынған препаратты кезекпен тасымалдағышта сорбирленген белокты жою үшін натрий ацетатты буфермен және хлорлы натрий ерітіндісімен жуады. Осылайша иммобилизацияланған фермент 3-5°С температурада су немесе буфер қабатының астында сақталады.