Ферменттік препараттарды алу

Ферменттік препараттарды алу

Жоспар

1.      Кіріспе

Ферменттік препараттарды алу

2.      Ферменттердің техникалық препараттары

3.      Саңырауқұлақ уыты

4.      Субтилин

5.      Глюкоамилаза

6.      Целлолитикалық ферменттік препараттар

7.      Ферменттерді бөліп алу және тазалау

8.      Ферменттердің және микроорганизмдердің тұтач жасушаларын иммобилизациялау

9.      Қорытынды

Ферменттік препараттарды алу

  Ферменттік препараттарды алу үшін микроскопиялық саңырауқұлақтарды, сондай-ақ бактериялар мен ашытқыларды пайдаланады. Кейде техникалық ферменттік препараттарды алу ферментация процесін жүргізумен аяқталады. Мысалы, спирт өнеркәсібінде крахмалды қанттандыру үшін aspergillus niger сұйық культурасын қолданады, ол крахмал(1%) мен түрлі тұздар қосу арқылы спирттік бордта тереңдік культивирлеу әдісімен өсіріледі. Кейін оны сұйық күйде 10-12% мөлшерде қанттандырылатын заторға қосады. Бірақ культуральды сұйықтықтағы ферменттердің белсенділігі тез төмендейді. Сондықтан құрғақ техникалық ферменттік препараттарды алу кең таралған.

Ферменттердің техникалық препараттары

  Кешенді амилолитикалық ферменттік препаратты қатты қоректік ортада көгерткіш саңырауқұлақтарды өсіріп, одан кейін алынған массаны кептіру және ұсақтау арқылы алады. Ферменттік белсендірек препаратын культуральды сұйықтықтан амилазаны ацетонмен тұндырып, одан кейін коагулятты 27-28˚С температурада кептіру арқылы бөліп алуға болады. Ферментті тұндыру үшін аммоний сульфатын жиі қолданады. Культуралды сұйықтықты алдын ала құрғақ заттардың мөлшері 40% жеткенше 40˚С температурада кептіріп алады. Коагулятты толықтырғышпен бірге кептіреді. Японияда тағамдық қажеттіліктер үшін ерекше крахмалмен өңделген культуралды сұйықтықтан ферментті адсорбциялау арқылы алынған амилазаның техникалық препаратын пайдаланады. Содан кейін амилазаны крахмалмен бірге лиофилизациялайды.

  Құрамында пектиназа болатын препаратты лимон қышқылы өндірісінің қалдықтары –aspergillus niger мицелийінен алады. Ол үшін оны кептіреді немесе экстракттан мицелийдің ақуызды фракциясын коагуляциялайды. Бұл препаратты жемістер мен жидектерді өңдеген кезде шырындарды ашық түстендіру және олардың шығымын арттыру үшін қолданады.

  Саңырауқұлақ уыты. Соңғы жылдары Кеңес Одағында құрғақ амилолитикалық ферменнттерді спирттік және сыра қайнату өнеркәсіптерінің және мал шаруашылығының қажеттіліктеріне пайдаланылады. Бұл препаратты жиі «саңырауқұлақ уыты»  деп атайды. Саңырауқұлақ уытын алу үшін таза культураны колбаларда, одан кейін кюветтерде көбейтеді. Бұл деңгейде қоректік ортаны стерильді бидай кебегінен дайындайды (0,1 MПа қысымда бір сағат бойы автоклавтау). Кебектің ылғалдылығын 45%-ға жеткізеді және оны тұз немесе күкірт қышқылымен қышқылдандырады. Суытқаннан кейін ылғалды кебекке таза культураны егіп, 30˚С температурада 3-4 тәулік бойы споралардың интенсивті түзілу кезеңіне дейін өсіреді. Кюветтерде таза культураны 32-33˚С температурада 10-12 сағаттан кейін 27-28˚С температурада толық споруляцияға дейін өсіреді. Таза культураны жақсырақ сақтау үшін  кюветтерде ылғалдылығы 20-25% болғанша, 40˚С теператураға дейін қыздырылған стерильді ауамен үрлеу арқылы кептіреді. Мұндай культураны 2 аптаға дейін сақтауға болады. Процесті ары қарай  жалғастыру үшін таза культура өңделетін кебек көлемінен 0,3% көлемінде керек.  

  Ферменттік препаратты беттік культивирлеу әдісімен алу технологиясы 1-ші суретте көрсетілген.  Басты ферментацияда қолданылатын кебектерді стерилизациялау үшін араластырғыштары, бу ағыны және салқындатқыш қондырғылары бар арнайы аппараттар пайдаланылады. Кебекті салқындату үшін стерильді ауа қолданылады. Алдымен люк арқылы аппаратқа кебекті енгізеді, кейін біртіндеп алдын-ала сумен сұйытылған 0,2% формалин(кебек мөлшерінен)қосады. Араластырғыштарды іске қосып, буды жібередіжәне 100-105˚С температурада кебекті 50-60 минут бойы стерилизациялайды. Содан соң аппараттың қаптамасы арқылы сумен жіне ауамен 37˚С температураға дейін салқындатылады. Массаның ылғалдылығын салқындатылған қайнаған сумен 56-58%-ке жеткізеді, таза культураны қосады да, жақсылап араластырады. Кюветалардың өлшемдері 0,5м2, бүйір қабырғасының биіктігі 25мм. Кюветалар перфорирленген  жасалады, тесіктердің өлшемдері 1,5×20мм. Камераға кюветаларды салудың алдында оны немесе бөлмені 8 сағат бойы бумен және формалинмен стерилизациялайды, содан соң 3-4 сағат стерильді ауамен желдетеді.

  Көгерткіш саңырауқұлақтарды өсіру екі кезеңде іске асады. Алғашқы 8-10 сағатта 32-33˚С температура, төмен аэрация және ауаның салыстырмалы ылғалдылығы 32-93%-дан аз емес жағдайда споралары ісініп өсе бастайды. Екінші кезеңде амилозаға бай мицелий түзіледі. Бұл кезде температураны 26-28˚С дейін төмендетеді, ауаны ылғалдандырып(96-100%), ауа алмасуын күшейтеді. Ауа барлық кюветаларға біркелкі беріліп отыруы маңызды. Ауа ағынының оптимальды жылдамдығы 1-1.5м/с. Ауа шығынын төмендету үшін таза ауаның 5-6%-ын ғана жіберіп, рециркуляциясын пайдаланады. 24-36 сағаттың ішінде кебектің беті ақ, ұлпа мицелийімен жабылады, массаның ылғалдылығы 38-40%.

Өсірілген мицелийді ауамен кептіріп(40-45˚C температурада), ұсақтауға жібереді. Содан соң препарат барабанды немесе басқа жіпті кептіргішке кептірілуге жіберіледі, мұнда оны 85-90˚С температурада 10-14% ылғалдылыққа дейін құрғатады. Кептіру кезінде материал температурасы 45-60˚С аспау керек. Құрғақ препаратты 25-40кг қаптарға салады.

   Aspergillus awamori культурасы препаратының амилолитикалық белсенділігі 10-14бірлік/г, декстринолитикалық белсенділігі 300-350бірлік/г, мальтазалық белсенділігі-180-200бірлік/г. Амилолитикалық белсенділік(АС) бірлігіне t=30˚C жағдайда бір сағат ішінде фосфодекстриндерден 1мг мальтозалардың түзілуін катализдеуге қабілетті фермент мөлшері сәйкес келеді. Декстринолитикалық белсенділік(ДС) бірлігіне 50˚С температурада және рН=4,5-5,0 болған жағдайда бір сағат ішінде фосфодекстриндерден 1мг мальтозалардың түзілуін катализдеуге қабілетті фермент мөлшері қабылданады.

  Субтилин. Протеолитикалық және амилолитикалық ферменттердің кешенін bacillus subtilis культурасының көмегімен алады. Олар аэробты, грамм оң, қозғалғыш, эндоспоралар түзетін таяқшалары. Бұл бактерияларға гидролитикалық ферменттердің өте бай кешені тән. Қоректену көзі ретінде олар ақуыздар, көмірсулар,спирттер және органикалық қышқылдарды пайдалана алады. Bacillus subtilis культурасын кебекте,сондай-ақ сұйық орталарда(ерекше құрамды) сәйкесінше беттік культивирлеу және терең культивирлеу әдістерімен культивирлейді.

  Культураны өсірудің беттік әдісінде процесс 30немесе 37˚С температурада 2-3тәулік жалғасады. Бұл кезде bacillus subtilis құрғақ препаратының амилолитикалық белсенділігі(АС) 150 бірлік/г төмен емес,ал протеолитикалық белсенділігі 6 бірлік/г аз емесболуы керек. Протеолитикалық белсенділік бірлігі 40˚С температурада және 7,0-7,3 РН мәнінде 1 сағат ішінде ақуыздардан 1мг аминдік азоттың түзілуін катализдейтін ферменттің мөлшерін сипаттайды.

  Bacillus subtilis терең ферментациясы үшін ортаны жүгері ұнының негізінде дайындайды. Ферментация басында РН*тың мәні 7,0-7,8, ал аяғында 6,5-6,9 болуы керек. Аэробты жағдайда екі тәулік ішінде амилазалар мен протеазалардың максималды мүмкін мәнінен 90%*ға жуығы синтезделеді. Ферментация аяқталған кезде культуральді сұйықтықты вакуумда 28˚С температурада буландырады, содан соң келіп түсетін ауаның температурасы 140-150˚С болатын шашыратқыш типті кептіргіштерде кептіреді. Ылғалдылығы 4-10% , протеолитикалық және амилолитикалық белсенділігі өте жоғары ұнтақ  тәрізді өнім алады.

  Глюкоамилаза.  Бұл фермент крахмалды глюкозаға дейін ыдыратады, сондықтан негізінен глюкоза өндірісі үшін пайдаланылады. Латв КСР ғылым академиясының А.Кирхенштейн атындағы микробиология институтында глюкоамилазаның техникалық және азықтық препаратын endomycopsis fibuliger ашытқыларының көмегімен алу әдісі дайындалды. бұл культура көміртек көздері ретінде крахмал(0.5-1%) және ашытқылық автолизат (10-25мл/л) қолданылатын Ридер ортасында ұзындығы 5,5-12мкм және диаметрі 4,8-6,0мкм жасушалар түзеді. Интенсивті араластыру болмаған жағдайда культура тармақталған мицелий түзеді. Культура азот көзі ретінде жасушалар жақсы ассимиляцияламайтын нитраттар мен несепнәрге қарағанда аммоний тұздарын жақсы пайдаланады. Endomycopsis fibuliger көміртек көзі ретінде крахмал, мальтоза, лактоза, фруктоза, этанолды жақсы пайдаланады; глюкоза, сахароза, парафиндерді-әлсіз; ал органикалық қышқылдарды мүлдем пайдаланбайды.

Ферментация процесі endomycopsis fibuliger R313 культурасын интенсивті аэрация жағдайында өсіруге келіп соғады. Ферментацияны культуралды ортаның жалпы мөлшерінен ингредиенттердің мөлшері келесідей болатын (массалық %-бен) қоректік ортада жүргізеді.

Ферментация процесін ортаның температурасы 34˚С, РН-7,5-8,0 немесе араластырғыштың 350-52 айн/мин айналу жиілігінде жүргізеді. Процесті бақылау үшін өсудің әрбір 3-4 сағаты сайын сынама алып отырады. Ортаның РН-ын, глюкоамилазалық белсенділігін, тереңдік культураның 100мл-гі биомасса мөлшері г-мен, микроскопиялық түрде жасушалардың жағдайы мен ботен микрофлораның болмауын анықтайды. Максималды глюкоамилазалық белсенділікке жеткен кезде процесті тоқтатады.

  Ферментация процесін ағынды режимде жүргізу мүмкіндігі көрсетілген. Endmycopsis fibuliger –мен үздіксіз әдіс бойынша жұмыс істеген кезде гомогенді хемостаттың динамикалық тепе-теңдігін D 0,10-нан 0,27сағ минус бір дәрежесіне дейін болған кезде анықталады және бұл кезде глюколипаза түзілуінің максималды меншікті жылдамдығы Kv=5.7г О2/л сағ болғанда, D=0,2сағ минус бір дәрежесі кезінде байқалады.

  Периодты және ағынды endomycopsis fibuliger R313 культурасының салыстырмалы бағалануы мына бірінші кестеде көрсетілген.ы

Кесте-1. Endomycopsis fibuliger R313 ашытқысын периодты және үздіксіз культивирлеу кезіндегі бірнеше физиологиялық және экономикалық көрсеткіштері

Ағынды режимде биомасса бойынша культураның өнімділігі 17есе және өнім бойынша 6есе периодты прцестің өнімділігімен салыстырғанда жоғары. Ферментация уақытында глюкоамилазаның белсенділігі 50-80 бірлік/мг дуйін жоғарылайды. Глюкоамилазалық белсенділікті (ГБ) глюкооксидазалық әдіспен анықтаған кезде белсенділік бірлігі ретінде еритін крахмалдан 1сағат ішінде 30˚С температурада 1мг глюкозаның түзілуіне әкелетін фермент мөлшерін қабылдайды.

   Содан кейін тереңдік культура жинағыштарға түседі, одан вакуум-буландырғыш аппаратқа барады, мұнда 34-40˚С температурада көлемі бойынша шамамен 10есеге буланып кетеді. Культуралдық сұйықтықтың концентратына концентраттағы құрғақ заттардың құрамына 100%мөлшерде NaCl толықтырғышын енгізеді. Кептіруді 130-150˚С, кептіргіштен шығарда 60-70˚С температурада жүргізеді. Алынған өнім толықтырғыштар қосу арқылы стандартталады, бөлінеді және қапталады.

   Культуралды сұйықтықтан глюкоамилазаның тазаланған ферменттік препаратын бөліп алуға болады. Бұл жағдайда культивирлеу процесі аяқталған соң тереңдік культурадан сепараторда немесе барабарды вакуум-фильтрде биомассаны бөліп алады. Биомассадан бөлінген культуралдық сұйықтық аралық жинағышқа жиналады да, одан вакуум-буландырғыш аппаратқа жіберіледі. Тұндыру үшін концентрациясы 96,0-96,5%көлемдегі этил спиртін пайдаланады. Тұндыру алдында концентратты 5˚С температураға дейін салқындатады. Тұндыруды тұрақты араластыра отырып, тұндырғышта, спирттің төрт көлемімен (қоспадағы концентрациясы 77%) немесе 0,7 қанығуда аммоний сульфатымен жүргізеді.

  Алынған тұнбаны ылғалдылығы 8-12% болғанша кептіріп шарлы диірменде ұнтаққа айналдырады.

  Целлолитикалық ферменттік препараттар. Кейбір елдерде беттік әдіспен, негізінен Trichoderma viride саңырауқұлағының культурасын пайдаланып целлюлозаларды өсіру жолға қойылған. Қазіргі кезде әлемдік тәжірибеде тереңдік культуралардан целлюлозалар алу әдістері көміртек көздері ретінде тазаланған целлюлозаны немесе құрамында целлюлоза бар табиғи субстраттарды пайдаланатын қоректік ортада целлюлозалардың редуцент-микроорганизмдерін өсіруді қарастырады. Бірақ ортаның негізгі компоненті ретінде табиғи целлюлозаны пайдаланатын тереңдік целлюлоза алу бірқатар технологиялық қиындықтарға әкеледі. Ал ферментация үшін тазаланған целлюлозаны пайдалану экономикалық жағынан тиімсіз. Құрамында еритін «индуктор» болатын қоректік ортаны пайдалану рационалды шешім болып табылады. Мұндай қоректік орта қызметін сүт өнеркәсібінің қосымша өнімі-сүт сарысуы атқара алады, оның негізгі компоненті лактоза болып табылады. БКСР ҒА-ның микробиология институты және Латв КСР ҒА-ның А.Кирхенштейн атындағы микробиология Институты целлюлолитикалық ферменттердің препараттарын алу технологиясын дайындады. Алдын ала сүт сарысуынан ақуызды бөліп алады.