Физико-химические методы исследований в биологии и экологии

Кондуктометрическое титрование

Электропроводность раствора может служить индикаторным свойством при проведении объемного анализа.  Так,  например,  содержание вещества в растворе может быть определено по изменению электропроводности в процессе добавления к раствору соответствующего реагента. Об эквивалентной точке титрования судят по изменению характера зависимости электропроводности раствора от объема добавляемого титранта.  Точку эквивалентности определяют по резкому излому кривой титрования (пересечению двух прямых), отражающему изменение электропроводности исследуемого раствора по мере прибавления титранта в процессе титрования.  Такой метод анализа называется кондуктометрическим титрованием. Метод особенно удобен при анализе мутных или окрашенных растворов,  когда нельзя использовать обычные индикаторы.

Конструкции измерительных  ячеек весьма разнообразны. В прямой кондуктометрии обычно применяют ячейки с жестко закрепленными в них  электродами. В методах кондуктометрического титрования часто используют так  называемые погружные электроды, позволяющие проводить титрование в любых сосудах, в которых можно разместить электроды. Кондуктометрические методы характеризуются высокой экспрессностью, простотой и достаточной точностью ( погрешность составляет 1 - 2 %, при соблюдении специальных условий она снижается до 0,2 % ), возможностью автоматизации и дистанционного управления. Ограничением метода является низкая селективность.

В медицине применяют кондуктометрические анализаторы.  Кондуктометрические А. могут быть использованы для счета элементов крови — эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, регистрации эритроцито-, лейкоцито- и тромбоцито-метрических кривых, определения гематокрита и среднего объема эритроцитов, комплексного исследования красной крови, определения средней осмотической резистентности эритроцитов, исследования механизма гемолиза, определения адгезивности и агрегации тромбоцитов, определения концентрации и размеров клеток костного мозга, количественного исследования гемагглютинации, определения продолжительности жизни эритроцитов перелитой крови методом дифференциальной агглютинации, количественного анализа цитотоксических антител, для определения уровня комплемента, исследования химеризма эритроцитов методом дифференциального гемолиза, исследования клеток в культурах тканей и органов, дифференциации клеток стромы и опухоли, определения концентрации и размеров сперматозоидов, анализа лекарств, онкологических диагностических исследований, выявления антиэритроцитных, антилейкоцитных и антитромбоцитных антител, исследования одноклеточных микроорганизмов (бактерий, простейших, грибов, водорослей), частиц жира и клеток в молоке и для других целей.

Потенциометрия

Потенциометрия - это метод  определения различных физико-химических величин, основанный на измерении электродвижущей  силы обратимых гальванических элементов.

Большое практическое значение имеют потенциометрические методы определения рН раствора со стеклянным и другими электродами,  а также прямые потенциометрические определения концентрации (активности) других ионов с помощью ионоселективных электродов (ионометрия и др. успешно применяют в анализе различных растворов, объектов окружающей среды и т.д.Во многих областях находит практическое применение кальциевыйионоселективный электрод.  Помимо традиционного анализа воды,  различных растворов большое практическое значение кальциевый электродимеет в медико-биологических исследованиях, клинической медицине ит.п., поскольку концентрация (активность) ионов кальция влияет на многие процессы жизнедеятельности и физиологические процессы (нервная деятельность, функция ферментов и т.д.). Известен мембранный ионоселективный электрод, позволяющий определять жесткость воды,  так как он имеет примерно одинаковую чувствительность на оба иона (кальций и магний). Основными достоинствами потенциометрического метода являются его высокая точность, высокая чувствительность и возможность проводить титрования в более разбавленных растворах, чем это позволяют визуальные индикаторные методы.  Необходимо отметить также возможности определения этим методом нескольких веществ в одном растворе без предварительного разделения и титрования в мутных и окрашенных средах.  Значительно расширяется область практического применения потенциометрического титрования при использовании неводных растворителей. Они позволяют, например, найти содержание компонентов, которые в водном растворе раздельно не титруются,  провести анализ веществ, нерастворимых или разлагающихся в воде и т.д.

Электрофорез

Электрофорезом  называют движение заряженных коллоидных частиц в постоянном электрическом поле к противоположно заряженному электроду. Биологические макромолекулы находятся в растворе в виде частиц, которые по своим размерам соответствуют коллоидным частицам. Кроме того, белки и нуклеиновые кислоты содержат ионизирующиеся группы,  вследствие чего в растворе они могут существовать в заряженной форме, в виде катионов или анионов. Молекулы с близкими по величине зарядами, но различающиеся молекулярными массами, отличаются друг от друга отношением заряда к массе. На указанных различиях основано разделение ионов при их движении в растворе под действием электрического поля. В этом и состоит принцип электрофореза.

Электрофорез  на бумаге –  самый простой из электрофоретических методов. Носителем служит, как правило, специальная хроматографическая бумага,  которая не требует никакой подготовки:  ее просто нужно разрезать на куски требуемого размера. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. После электрофореза белки фиксируют высушиванием, а затем красят красителями,  специфичными для белков.  Окрашенные полосы белковых фракций можно хранить или, разрезав на участки,  элюировать для фотометрического определения каждой фракции.  При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови удается получить до 5 фракций. Бумага не является абсолютно инертным носителем и может адсорбировать некоторые вещества  (это нежелательное ее свойство удается устранить при использовании ацетата целлюлозы).  Кроме того,  при электрофорезе на бумаге вследствие особенностей ее химического состава в той или иной степени проявляется электроэндоосмос  (то есть возникновение заряда между молекулами буферного раствора и поверхностью носителя), что резко снижает разрешающую способность метода.

Электрофорез  в гелях. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агаровый, полиакриламидный гели. Характерной особенностью данной разновидности зонального электрофореза является высокая разрешающая способность. Дело в том, что гели являются не только поддерживающей средой, они функционируют как молекулярные сита. Принцип действия молекулярного сита состоит в том, что крупные молекулы двигаются через него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Гель-электрофорез особенно ценен для разделения смесей веществ,  имеющих одинаковые заряды,  но слегка различающих по массе. Электрофорез в ПААГе в настоящее время является самым эффективным из существующих методов и широко используется в различных областях биологии. Этот метод обладает большей разрешающей способностью по сравнению с методами, где используются другие гели. Полиакриламидный гель прозрачен,  обладает значительной механической прочностью,  однороден по составу,  химически инертен.  Размер пор у ПААГа можно варьировать в широких пределах, его можно применять с самыми различными буферами,  удобно использовать для количественного определения разделяемых веществ. Метод электрофореза в полиакриламидном геле широко используется в различных отраслях биологических,  экологических и медицинских исследований.  Приведем лишь некоторые примеры его применения: 1) в медицине  (диагностика заболеваний -  изучение белков и ферментов различных органов и тканей в норме и патологии); 2) в серологии (разделение белков сыворотки крови для определения родов и видов и их идентификации); 3) в генетике  (выявление мутаций путем изучения белковых спектров); 4) в гистологии и цитологии (анализ компонентов клеточных фрагментов и тканей); 5) в ботанике (исследование белков семян растений); 6) в микробиологии (изучение белков бактерий,  вирусов и фагов, определение принадлежности микроорганизмов к определенному штамму); 7) в биохимии (изучение белковых спектров, множественных молекулярных форм ферментов,  разделение смесей нуклеиновых кислот в различных органах и тканях организмов); 8) в экологии (изучение влияния абиотических и биотических факторов окружающей среды на биохимические показатели обитающих в ней организмов).

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ  МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Хроматографией  называют физико-химический метод,  основанный на различии скорости переноса растворенных веществ в системе двух фаз, одна из которых подвижна. Отличительной чертой хроматографического метода является разделение смеси веществ на основе распределения между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижная, а другая - подвижная,  непрерывно протекающая через неподвижную фазу.  В роли подвижной фазы чаще всего выступает газ или жидкость,  а в качестве неподвижной фазы -  жидкость или твердое вещество.  Разделение может происходить за счет установления:

а) адсорбционного равновесия между неподвижной  твердой и подвижной жидкой фазами (адсорбционная хроматография);

б) равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной газовой фазами (газо-жидкостная хроматография);

в) равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной жидкой фазами (хроматография на бумаге);

г) ионообменного равновесия между ионообменной смолой (неподвижная фаза) и электролитом (подвижная фаза) (ионообменная хроматография);

д) равновесия между жидкой фазой на внутренней и внешней поверхностях пористой структуры или "молекулярного сита" (эксклюзионная или проникающая хроматография);

е) равновесного связывания макромолекулы с малой молекулой, по отношению к которой она проявляет высокую биологическую специфичность, а следовательно, и сродство (аффинная хроматография).

Жидкостно-адсорбционная  хроматография

В жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент,  а подвижной -  жидкость.  Она основана на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбент в общепринятом смысле представляет собой твердое вещество,  способное удерживать на своей поверхности молекулы.  Эта способность особенно ярко выражена в тех случаях,  когда поверхность адсорбента содержит большое количество мелких пор.Адсорбенты подразделяются на неполярные  (гидрофобные) -  активированный уголь -  и полярные  (гидрофильные) -  силикагель,  оксид алюминия, искусственные и природные силикаты. Адсорбционное сродство полярных веществ с полярными адсорбентами значительно выше неполярных. Это различие используется при выборе адсорбентов.

Хроматография на колонке

Колонка для адсорбционной хроматографии представляет собой стеклянную трубку, заполненную адсорбентом. На адсорбент в колонке наносят смесь веществ.  Затем через них пропускают растворитель или смесь растворителей,  служащих подвижной фазой,  т.е.,  как правило, применяют проявительный способ хроматографии. Разделение основанона том,  что вещества с более высоким эффективным коэффициентом распределения продвигаются на колонке с большей скоростью,  отделяясь таким образом от веществ более низким коэффициентом. Если исследуемые вещества окрашены,  то при разделении можно видеть движение по колонке окрашенных зон. Образующиеся в результате разделения зоны извлекают одним из двух способов. В первом случае столбик сорбента выталкивают из колонки, зоны разделяют шпателем.  Затем элюируют из зон разделенный материалческой, что позволяет избирательно адсорбировать одно вещество из смеси. В настоящее время жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке применяется при разделении и изучении состава углеводов, фенолов,  углеводородов,  липидов,  стероидов,  производных аминокислот, компонентов нуклеиновых кислот, алкалоидов, пестицидов, витаминов и других веществ.

Тонкослойная  хроматография (ТСХ)

Тонкослойная  хроматография занимает особое место среди других хроматографических методов благодаря простоте методики и доступности оборудования, широкой области применения, высокой экономичности, достаточно высокой селективности и чувствительности. Данный метод успешно применяется для разделения очень малых количеств веществ  (до 0,1 - 0,005  мкг). В отличие от колоночной хроматографии при ТСХ слой сорбента наносят на горизонтальную стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинки (ТСХ с незакрепленным слоем) или применяют закрепление слоя крахмалом,  сульфатом кальция и другими связывающими агентами. Процедура анализа смеси веществ методом ТСХ такова.  На расстоянии 1,5-2 см от короткого края пластинки проводят поперечную линию, являющуюся линией старта, и на нее капиллярами, микропипетками или микрошприцами в виде точки или полоски наносят анализируемую смесь и стандартные вещества (“свидетели”). В одну точку можно наносить 50  мкг 1 мг вещества.  После нанесения образцов на сорбент пластинку переносят в герметичную камеру для хроматографического анализа и погружают в растворитель, который выполняет роль подвижной фазы.  Растворитель  (или смесь растворителей) заливают заранее в хроматографическую камеру, чтобы в ней установилась равновесная упругость паров. В противном случае растворитель, поднимаясь вверх по пластинке, будет интенсивно испаряться, что отразится на качестве разделения.  При погружении пластинки в растворитель нужно следить затем, чтобы стартовая линия была выше уровня растворителя. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению.  Принцип разделения такой же,  как в других видах хроматографии, -  неодинаковое сродство разделяемых веществ к подвижной жидкой фазе и стационарному сорбенту. После достижения растворителем линии фронта пластинку высушивают и проводят идентификацию компонентов смеси.  Многие вещества не обнаруживаются в видимой области, и для их определения невидимые зоны  (пятна)  проявляют опрыскиванием пластины ТСХ специальными реагентами. Неокрашенные вещества иногда выявляют также с помощью выдерживания пластинки в течение нескольких минут в парах йода,  или ее облучают УФ-лучами или проводят термическую деструкцию разделяемых веществ.

Проникающая или эксклюзионная хроматорафия.

Подвижной фазой в проникающей хроматографии является растворитель (жидкость), а неподвижной -  та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля), т.е. и подвижную, и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь веществ. Гель готовят на основе декстрана,  полиакриламида или других природных и синтетических соединений. Способность молекул анализируемого вещества проникать в растворитель, поглощенный частицами набухшего геля, зависит от степени пористости частиц геля и от размера молекул соединения.  Распределение веществ на колонке, заполненной набухшим гелем, зависит от общего объема растворителя внутри и снаружи частиц геля. Проникающая  (эксклюзионная)  хроматография используется для очистки высокомолекулярных биологических соединений. Так проводяточистку и разделение вирусов,  белков,  ферментов,  гормонов,  антител, нуклеиновых кислот и полисахаридов.  Этим методом можно отделять аминокислоты от пептидов, фракционировать пептиды, образующиеся в результате гидролиза белков, а также олигонуклеотиды из гидролизатов нуклеиновых кислот.  Метод проникающей хроматографии позволяет определять молекулярные массы неизвестных белков,  проводить обессоливание белков и концентрирование их растворов,  а также удалять фенол из растворов нуклеиновых кислот, моносахариды отделять от полисахаридов и аминокислоты от белков. С помощью этого вида хроматографии в Институте вирусологии в Москве в 1990 году был выделен вирус СПИДа.