Физико-химические методы исследований в биологии и экологии

Физико-химические методы анализа и исследования -  это условное название большого числа способов количественного и качественного определения веществ,  которые предполагают, как правило, применение различных, часто довольно сложных, измерительных приборов.  За рубежом в большом распространении термин  “инструментальные методы анализа”  или “приборные методы”.  В основе физико-химических методов лежат законы физики и физической химии,  а аппаратурное оформление основано на применении современных достижений оптики и электроники. Общее число физико-химических методов анализа довольно велико –  оно составляет несколько десятков.  Наибольшее практическое значение среди них имеют следующие:

1) спектральные и другие  оптические методы;

2) электрохимические методы;5

3) хроматографические методы анализа.

СПЕКТРОСКОПИЯ (от лат. spectrum-образ, представление и греч. skopeo-смотрю), раздел физики, изучающий спектры электромагн. излучения. Спектры возникают при переходах между уровнями энергии в атомах, молекулах и образованных из них макроскопич. системах. В современной медицинской диагностике широкое распространение получают оптические методы исследования живых тканей, получившие название «оптическая биопсия» (Optical Biopsy) (Bigio, 2003; Popp, 2006). В оптической биопсии используются как оптическая спектроскопия  –абсорбционная, флуоресцентная, спектроскопия комбинационного рассеяния света, так и методы медицинской оптической визуализации  - оптическая когерентная томография (Brezinski, 1996), конфокальная лазерная эндомикроскопия, эндоцитоскопия (Newton, 2011). Основное преимущество использования оптической биопсии заключается в высокой скорости проведения анализа. Вторым достоинством является возможность исследований с высоким пространственным разрешением. Уникальным свойством оптической биопсии является возможность прямого исследования метаболических превращений в клетках живых тканей (Adachi, 1999; Vishwasrao, 2005)

Абсорбционная спектроскопия.

Данный спектроскопический метод основан на фотофизическом процессе поглощения. Поглощение –  это процесс, представляющий собой  уменьшение интенсивности оптического  излучения при прохождении через  какую-либо среду за счёт взаимодействия с молекулами вещества, в результате которого световая энергия переходит  в другие виды энергии или в  оптическое излучение другого спектрального  состава. Области спектра, где это  явление  возникает, называются полосами поглощения. Три основных типа процессов  поглощения:

• Электронный (атомы, молекулы)
• Колебательный (молекулы)
• Вращательный (молекулы)

Молекулы поглощают свет. Длины волн при которых происходит поглощение  и степень поглощения зависят от структуры и от окружения молекулы, поэтому абсорбционная спектроскопия является полезным инструментом  для характеристики молекул разного размера. Методы ультрабыстрой лазерной спектроскопии позволяют проводить исследования динамики внутреннего движения биомолекул.  С помощью этих методов исследуются сверхбыстрые процессы колебательного и электронного возбуждения биомолекул, а также динамика химических реакций с их участием. Абсорбционные методы позволяют определять полное время релаксации биомолекул в основное состояние, время их колебательной релаксации, скорость передачи возбуждения в смеси биомолекул, скорость передачи заряда между биомолекулами в смеси акцепторов и доноров, динамику фотодиссоциации биомолекул в растворе, скорость конформационных изменений и пр. Исследуются первичные процессы фотосинтеза организмов — пурпурных и зеленых бактерий; динамика фотосистем I и II в зеленых растениях и водорослях; первичные стадии преобразования энергии света родопсинами при изучении фотохимии зрения и биоэнергетики галофильных бактерий (бактериородопсин); фотообратимые фотохромные пигменты (фитохром), выполняющие биорегуляторные функции в клетках многих простейших и растений; динамика фотодиссоциации гемопротеинов (гемоглобина и миоглобина) и др. Измерение поглощения производится при помощи спектрофотометра. Применяют данный метод для определения концентрации. Для идентификации веществ (так как все вещества имеют характерные спектры поглощения.

Инфрокрасная спектроскопия.

Позволяет идентифицировать многие биохимические соединения и  изучить их свойства по полосам поглощения, находящимся в ИК-области спектра.

ИК-спектроскопия  наибольшее употребление находит для определения структуры органических соединений.  Изучение структуры оказывается возможным,  благодаря особенностям взаимодействия инфракрасного излучения с веществом.  Как было показано выше,  электронные спектры несут ограниченную информацию о строении скелета молекулы.  Поглощение видимых и ультрафиолетовых лучей сопровождается изменением энергии электронных оболочек атомов и молекул. Энергия квантов инфракрасного излучения значительно ниже интервалов между электронными энергетическими уровнями, поэтому состояние электронной оболочки при поглощении инфракрасных лучей не изменяется. В поглощении инфракрасных излучений веществом принимает участие система колебательных энергетических уровней молекулы,  расстояние между которыми соответствует энергии квантов инфракрасных лучей. Колебательные спектры обусловлены в первую очередь смещениями ядер атомов,  вследствие этого по ИК-спектрам можно устанавливать структуру молекул

Спектральные характеристики (положения максимумов полос, их полуширина, интенсивность) индивидуальной молекулы зависят от масс составляющих ее атомов, строения, особенностей межатомных сил, распределения заряда и др. Поэтому ИК-спектры отличаются высоким уровнем индивидуальности, что и определяет их ценность при идентификации и изучении строения соединений (особенно органических). В целом ИК-спектры характеризуют энергетическое состояние молекул, касающееся, в первую очередь, колебательных и вращательных движений ядер атомов и молекул. Поэтому их часто называют молекулярными спектрами, а метод относят к нанотехнологиям. Экспериментальные исследования большого числа молекул, обладающих одними и теми же химическими группами, показали, что независимо от изменений в остальных частях молекулы эти одинаковые группы поглощают энергию в узком интервале частот. Такие частоты получили название характеристических или групповых. К ним относятся, например, колебания групп С-Н, СH2, CH3, O-H, N-H, NH2, C=C, C=O, NO2, P=O, P-O-P и др.. Наличие характеристических частот обусловлено тем, что в таком колебании наибольшее участие принимает некоторая группа атомов, а вклад остальной части молекулы мал, хотя, строго говоря, в каждом колебании изменяются длины связей и величины углов между ними. Таким образом, любое индивидуальное органическое вещество или смесь веществ имеют свои собственные неповторимые ИК-спектры, которые могут быть интерпретированы как качественно, так и количественно.Для регистрации ИК-спектров используют классические спектрофотометры и фурье-спектрометры.Метод применяют для диагностики онкологических заболеваний крови, обнаружения опухолей в костях.

Флуоресцентная спектроскопия

Среди методов оптической биопсии особое место занимает анализ люминесценции живых тканей. Во-первых, этот метод обладает наивысшей чувствительностью. Во-вторых, параметры люминесценции весьма чувствительны к состоянию микроокружения флуоресцирующего агента (флуорофора), что позволяет отслеживать степень его агрегации, свойства микроокружения, включая полярность и жесткость среды, наличие поблизости зарядов и молекул – акцепторов энергии электронного возбуждения. Флуоресцентные методы оптической биопсии можно условно разделить на два класса: 1) методы, основанные на регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров  – аутофлуоресценции (Monici, 2005); 2) методы, использующие различные флуоресцирующие соединения - флуоресцентные метки и зонды, вводимые в ткань для визуализации исследуемых процессов (Michalet, 2005). Использование собственной флуоресценции (аутофлуоресценции)  для прижизненной диагностики тканей является наиболее привлекательным, поскольку практически не меняются условия протекания в них основных биохимических процессов. Собственная флуоресценция тканей in vivo исследуется достаточно давно. Накоплен значительный экспериментальный материал по использованию этого метода в диагностических целях в различных областях медицины  –гастроэнтерологии, стоматологии, дерматологии.

Флуоресцентные методы –  дают информацию об изменении конформации макромолекул под влиянием окружения, либо связывания с другими молекулами

Флуоресцентная спектроскопия  – весьма чувствительный метод анализа  химического состава образца, позволяющий  обнаруживать следовые количества веществ  и даже их отдельные молекулы. Данный метод основан на специфическом свойстве молекул.  Флуоресценция – это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Спектр испускания вещества представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждения света  При поглощении фотона макромолекулы способны испускать свет (флуоресценция). Спектры флуоресценции ещё в более высокой степени, чем спектры поглощения зависят от окружения. Многие молекулы биологических веществ являются природными или естественными флуорофорами, т. е. веществами, способными флуоресцировать в определенном диапазоне длин волн при соответствующих условиях возбуждения, например белки. Исследование собственной флуоресценции биологических материалов не всегда позволяет получить желаемую информацию об объекте. В таком случае используют искусственные флуорофоры, т. е. специально синтезированные вещества, имеющие специфический спектр флуоресценции либо в свободном состоянии, либо при связывании с тем или иным объектом исследования. Флуоресценция таких веществ (зондов), как правило, обладает высоким квантовым выходом и достаточно большим временем жизни. Они применяются в медицине для исследования проходимости лекарственных веществ через клеточные мембраны и мембраны органоидов, а также при исследовании молекулярных механизмов влияния на клетки различного генеза физико-химических методов. С помощью флуоресцентных зондов можно исследовать молекулярные механизмы возникновения и развития патологических процессов, действие на организм биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Флуоресцентные зонды применяются также для диагностики и прогноза развития заболеваний, выявления факторов риска и контроля эффективности лечения. Зондовая флуоресценция чувствительна к структурно-функциональным изменениям в биологических мембранах, микровязкости ее липидного бислоя, связыванию с белками и другими веществами, структурным перестройкам в белках, изменению мембранного потенциала и концентрации внутриклеточного кальция и др. Анализируя спектр флуоресценции клеток и мембран, связанных с зондом, можно определить полярность микроокружения флуорофора. Интенсивность и время жизни флуоресценции зонда характеризуют подвижность сольватной оболочки, поляризация флуоресценции – вращательную подвижность, ориентацию и вязкость микроокружения зонда. Тушение флуоресценции зонда посторонними веществами позволяет установить доступность флуорофора для тушителя, его локализацию в белках и мембранах клеток и их проницаемость для тушителей, скорость диффузии. По переносу энергии возбуждения с мембранных белков на флуоресцентный зонд и по степени эксимеризации зонда можно определить расстояние между флуорофорами и вязкость среды, окружающей зонд.

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА.

Электрохимические методы анализа основаны на использовании электрохимических процессов,  происходящих в электролитической ячейке  (гальваническом элементе,  цепи).  Электролитическая ячейка представляет собой электрохимическую систему,  состоящую из элек-тродов и электролитов, контактирующих между собой. На границе раде-ла фаз может происходить электродная реакция между компонентами этих фаз, в результате которой электрический заряд переходит из одной фазы в другую, и на межфазной границе устанавливается потенциал. В состав электролитической ячейки входят два или три электрода, один из которых -  индикаторный или рабочий, второй -  электрод сравнения и третий - вспомогательный. Электрод, действующий как датчик, реагируя на фактор возбуждения и на состав раствора (не оказывая влияния на состав раствора за время измерения),  является индикаторным.  Электрод сравнения служит для создания измерительной цепи и поддержания постоянного значения потенциала индикаторного  (рабочего)  электрода. Используемый в трехэлектродной ячейке вспомогательный электрод (противоэлектрод) вместе с рабочим электродом включен в цепь,  через которую проходит электрический ток.  В состав электролитической ячейки могут входить два идентичных электрода, выполняющих одинаковую функцию. Электрохимические методы анализа основаны на использовании зависимости электрических параметров от концентрации,  природы и структуры вещества, участвующего в электродной (электрохимической) реакции или электрохимическом процессе переноса зарядов между электродами. Согласно рекомендациям ИЮПАК электрохимические методы анализа можно классифицировать следующим образом: 1) методы без протекания электродной реакции,  в которых строение двойного электрического слоя в расчет не принимается  (кондуктометрия); 2) методы,основанные на электродных реакциях в отсутствие тока (потенциометрия)  или под током  (вольтамперометрия,  кулонометрия,  электрогравиметрия).

Кондуктометрия

Кондуктометрия –  это  метод определения различных  физико-химических величин,  основанный на измерении электрической проводимости (электропроводности).

Электропроводностью называют способность растворов электролитов проводить электрический ток  под действием внешнего электрического поля. Для определения электропроводности может использоваться кондуктометрическая  ячейка –  стеклянный сосуд без  дна с двумя электродами известной  площади (S), прочно укрепленными на фиксированном расстоянии друг от друга (L). Электроды выполнены из платиновой черни. Ячейку погружают в раствор электролита. Сопротивление кондуктометрической ячейки измеряют при помощи специального устройства – мостика Уитстона. . Скользящий контакт перемещается по проволочному сопротивлению до тех пор, пока осциллограф не зарегистрирует минимальный сигнал. После того,  как найдено сопротивление ячейки,  можно вычислить электропроводность раствора. Различают прямую кондуктометрию и кондуктометрическое титрование. Прямая кондуктометрия - метод, позволяющий путем непо-средственного измерения электропроводности раствора определять концентрацию электролита. Кондуктометрическое титрование основано на измерении электропроводности раствора неизвестной концентрации в процессе титрования. Конец титрования находят по излому хода кривых титрования до и после точки эквивалентности в координатах: электропроводность - объем рабочего раствора.