Технология получения Декстраназы

Содержание

 

        Введение

 

     Ферменты - это специфические катализаторы белковой природы, вырабатываемые клетками и тканями организмов. Они способны во много раз ускорять течение химических и биохимических реакций, не входя в состав конечных продуктов. Практические применения ферментов основаны на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими каталитическими системами субстратной специфичностью. Источником ферментов служат растительные и животные ткани, микроорганизмы. Химический синтез ферментов в промышленных масштабах очень сложен, дорог и экономически не целесообразен. Микробиологический метод получения ферментов - наиболее перспективен. Его преимущества заключаются в следующем: 1) богатство ассортимента ферментов, синтезируемых микроорганизмами, 2) возможность управления ферментативными системами и составом производимых препаратов, 3) высокие скорости размножения микроорганизмов и возможность использования различных, в том числе доступных и недорогих субстратов. Ферменты в микробных клетках могут иметь как внутриклеточную локализацию, так и выделяться в окружающую среду. Последние более доступны для препаративного получения, поэтому в промышленных масштабах получают главным образом внеклеточные ферменты. Из описанных к настоящему времени более 2000 ферментов практическое значение имеют около 50.

Ферменты, деполимеризующие декстран, а также продуцирующие их микроорганизмы, уже достаточно длительное время являются объектом интенсивных исследований. Повышенный интерес к декстраназам обусловлен, прежде всего, возможностью их использования для получения продуктов частичного или полного расщепления декстранов, которые находят все большее практическое применение. Еще одна причина, которая привлекает внимание к декстраназам, является возможность их использования для удаления декстрана из производственных потоков, поскольку его присутствие затрудняет промышленный процесс получения сахара и анализ продуктов.

Важной сферой практического  применения декстранолитических ферментов является профилактика и лечение кариеса зубов. Интерес к декстраназам в этом направлении не ослабевает, о чем свидетельствует возрастающее количество публикаций, а также наличие противокариесных препаратов, выпускаемых зарубежной и отечественной промышленностью.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     Глава 1. Характеристика препарата.

        Декстраназу получают методом глубинного культивирования, продуцентом   является сенная  па́лочка (Bacillus subtilis).

  Сенна́я па́лочка (Bacillus subtilis) —грамположительная, спорообразующая аэробная почвенная бактерия. Является продуцентом некоторых полипептидных антибиотиков, а также ферментов (амилазы, декстраназы)  получаемых промышленно. Декстраназа  высокоочищенный препарат, получаемый из ферментных экстрактов глубиной  аэробной  культуры.

Бактерии Bacillus Subtilis по составу биологически активных веществ способен к созданию на его базе лечебно-профилактических препаратов для потребностей медицины и ветеринариии и после проведения с ним температурно-проточно-ультразвуковой обработки, значительно повышается эффективность действия биологически активных компонентов, полученных из штамма Bacillus Subtilis.

      1.1.Показатели (нормы):

    Внешний вид, цвет:   Аморфный порошок от белого с  кремовым  оттенком , до светло-бежевого     цвета со специфическим запахом. опускается серый  оттенок.                Форма выпуска:  Декстраназа  обладает  выраженным антибактериальным в   отношении   кариесогенной    микрофлоры    и   противокариесным эффектом, гидролизует декстран зубного налета.  Из декстраназы    получают    таблетки,     используемые   в  стоматологической практике, а также в качестве антисептической добавки к зубным пастам. 

 Упаковка. По 1 кг в полиэтиленовые пакеты.  Рабочая зона действия при рН от4,5 до 5,7. Оптимальные температуры лежат в интервале от 55-60⁰С.    Хранение: В сухом, прохладном месте.  Срок годности: от 6 месяцев до 1г.

 

 1.2 Катализируемая реакция.

   Декстраны представляют  собой группу высокомолекулярных  бактериальных экзополисахаридов, состоящие в основном из а-1,6-связанных D-глюкопиранозных единиц. В расщеплении декстранов участвует ряд ферментов, различающихся по специфичности и механизму действия.

 По способу действия  на субстрат эти ферменты обычно делят на эндо- и экзо-декстраназы. Однако более детальное исследование каталитического                           воздействия различных декстраназ позволило разделить их на декстраназу.

 

Ферменты, расщепляющие декстран, обнаружены у различных  групп микроорганизмов, включая бактерии, плесневые грибы, дрожжи, а также у животных, человека и высших растений. Грибные продуценты,как равило, синтезируют внеклеточные декстраназы эндо-типа. Среди дрожжевых культур описаны продуценты как эндо-декстраназ, так и экзо-1,6-а-глюкозидаз. Особенностью бактериальных продуцентов является способность большинства из них к биосинтезу одновременно нескольких глюкозидаз, отличающихся по локализации и субстратной специфичности, что имеет определенный биологический смысл.  Помимо применения традиционных методов отбора и селекции предпринимаются попытки получения бактериальных продуцентов декстраназ с помощью генной инженерии. В данной области значительный интерес представляют работы по клонированию генов экзо- и эндо-декстраназ, получившие распространение.

1.3 Применение и назначения препарата.

Декстраназа широко применяются в медицине, особенно в стоматологии.    Декстраназы вводимые в состав зубных паст, имеют достаточно широкий спектр действия. Ферменты растворяют органический материал зубного налета, не повреждая при этом живые ткани, благотворно действуют на ткани пародонта и слизистую оболочку полости рта, утилизируют токсические и раздражающие продукты жизнедеятельности микроорганизмов зубной бляшки, оказывают прямое или опосредованное бактерицидное и бактериостатическое действие. 
В качестве компонентов зубных паст использовались протеазы, декстраназы, карбогидраза, инвертаза, мутаназа, оксиредуктаза, лактатдегидрогеназа, амилглюкозидаза.  
    Применяются также ферменты, обладающие антимикробным и противовирусным действием - лизоцим, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза, пероксидаза, глюкозооксидаза, лактопероксидаза. Довольно часто применяются комбинации ферментов: карбогидраза, протеаза и липаза, декстраназа, амилаза и мутаназа, декстраназа, амилглюкозидаза, лактопероксидаза и лизоцим. 
    К ферментсодержащим зубным пастам можно отнести пасты Biotene (содержит глюкозооксидазу, лактопероксидазу, лизоцим, натрия моно-фторфосфат и ксилитол), Протодент (содержит протеазу), First Teeth (содержит лактопероксидазу и лактоферрин). Они показаны при значительном образовании неминерализованных зубных отложений, гипосаливации, повышенной вязкости слюны,дисбактериозе полости рта. Ферменты являются лабильными соединениями, поэтому в состав зубных паст вводятся стабилизаторы (например, для декстраназы это - желатин, натрия или калия хлорид, сорбиновая кислота, алюминия гидроксид, эвгенол, натрия салицилат, ацилтаурат, сорбит, растворимые соли серной кислоты).  Непосредственное применение декстраназы показано на примере  таблетированного препарата Декстраназа.    
     Декстраназа обладает выраженным антибактериальным в отношении кариесогенной микрофлоры и противокариесным эффектом, гидролизует декстран зубного налета. Разрушение сформированных мягких зубных отложений может быть осуществлено при помощи химических и физических механизмов. К химическим средствам относятся поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые разрыхляют структуру налета, а также ферменты, разрушающие органический матрикс налета: лизоцим (в том числе слюнной), панкреатин, декстраназа, рибонуклеаза. Эти препараты являются составляющими многих оральных гигиенических продуктов. Известен опыт, когда ежедневное применение сосательных таблеток декстраназы в течение месяца обеспечило 50% годовой редукции прироста кариеса.

Глава 2. Технология получения препарата.

Производственная питательная  среда для культивирования штамма Bacillus subtilis  продуцента декстраназы имеет следующий состав:

Крахмал картофельный

Кукурузный экстракт

Дрожжи пивные

Лактоза

Медь сернокислая

Аммоний фосфорнокислый

Натрий хлористый

Магний сернокислый

Калий сернокислый

Кальций хлористый

Данная питательная среда для Bacillus subtilis очень широко используется в промышленном получении декстраназы, рН среды не должна выходить за пределы 4,5-5,7 (слабокислая среда). Используемые в данной питательной среде для Bacillus subtilis кукурузный экстракт и пивные дрожжи являются стимуляторами роста биомассы Bacillus subtilis , это позволяет увеличить амилолитическую активность.

Культура Bacillus subtilis выращивается в пробирках на агаризованной среде в термостате при 37ºС в течении одних суток. Посев производится уколом в глубину питательной среды. Далее культура культивируется на качалках в колбах объемом 750 мл. При температуре 37ºС 46 часов, частота движения качалки 180-200 об/мин. В качестве среды используется производственная. После культура подается на стадию инокуляции. Процесс проходит при следующих условиях: температура 37ºС, избыточное давление 0,1 МПа, расход воздуха 258 м3/час, время 48 часов. После инокуляции маточный раствор стерильно подается в два параллельных ферментатора, где непосредственно производится процесс культивирования. Условия ферментации следующие: температура 37ºС, избыточное давление 0,1 МПа, расход воздуха 2580 м³/час, время ферментации 72 часа.

Стерилизация питательной среды и воздуха для культивирования Bacillus subtilis

Стерилизацию питательной  среды проводят автоклавираванием  при температуре 127ºС в течении 20 минут, затем охлаждают до 36 – 38 ºС. Атмосферный воздух с помощью вентилятора закачивается в воздушный фильтр, далее поступает в общий фильтр бактериальный фильтр, где очищается от основной массы бактерий.

Стадии очистки  и выделения фермента декстраназы из культуры Bacillus subtilis

Культуральная жидкость из сборника готовой культуры подается на фильтр, где освобождается от биомассы бактерий, которая в последствии инактивируется. Фильтрат культуральной жидкости осаждается ацетоном (в соотношении 1: 2) и центрифугируется (5000 об/мин). Образовавшийся осадок декстраназ растворяют в воде при температуре 55-60ºС , после чего фильтруют. Фильтрат обрабатывают гелем фосфата кальция и охлаждают в течении 2 часов, а затем центрифугируют. Далее фугат разбавляют в два раза водой, осаждают ацетоном и центрифугируют. Образовавшийся осадок хроматографически очищают на сефадексе G – 25 и осаждают ацетоном (в соотношении 1: 4). Осадок измельчают до размеров частиц не более 1-2 мм и сушат в распылительной сушилке при температуре 40±2ºС в течении 5-8 минут. Высушенный препарат декстраназы направляют на упаковку.

2.1 Продуцент фермента

В качестве продуцентов  декстранолитических ферментов  при глубинном культивировании  в промышленных условиях используют бактерии в основном рода Bacillus, реже –  микроскопические грибы. Способность к образованию декстранолитическтх ферментов отмечается практически у всех известных микроорганизмов, так как роль этих ферментов в регуляции жизненных функций организмов очень велика. 

 

2.2 Источники   углерода

В качестве источника  углерода в данной среде используется картофельный крахмал, который также служит в роли инициатора синтеза амилолитических ферментов, в частности для Bacillus Subtilis – декстраназы.

Крахмал - растительный полисахарид  с очень сложным строением. Это  двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30% амилозы и 70-85% амилопектина. Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы соединены 1, 4-гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. В «аномальных» амилозах с одной-двумя  1, 6-связями полимеризация может возрасти до 6000.

Крахмал картофельный представляет собой сыпучий порошок белого или слегка желтоватого цвета нерастворимый в холодной воде. Крахмал по химическому составу и строению относится к углеводам. Крахмальные зерна состоят из двух природных фракций - амилозы и амилопектина. Хорошо усваивается организмом.

Химическая формула: (C6H10O5)n.

Картофельный крахмал  применяется:

- В качестве наполнителя/загустителя в пищевой промышленности (Е1400-Е1404): мясная отрасль (вареные колбасы, сосиски, сардельки, фарши и фаршевые изделия, ветчины, мясные начинки), рыбная отрасль (крабовые палочки, рыбные полуфабрикаты - котлеты и т.п.), пищеконцентратная отрасль (фруктовые и плодово-ягодные кисели), фасовка для розничного потребления (упаковка массой нетто до 1 кг);

- В качестве основного  сырья для производства картофельного  модифицированного крахмала; декстринов; мальтодекстрина и пр.;

- В химико-фармацевтической промышленности в качестве наполнителя в таблетированных лекарственных средствах и присыпках;

- В текстильной промышленности (для процесса шлихтования нитей,  т.е. пропускания нитей основы  через клеящий состав - шлихту, создающий  после высушивания на нити гладкую, эластичную плёнку, которая предохраняет нить от разрыва при ткачестве; а также для процесса аппретирования - заключительная операция по отделке ткани, в результате которой повышается износоустойчивость, улучшается внешний вид, облегчается раскрой и придается гибкость ткани, увеличивается наполненность ткани);