Обратная транскрипция: значение, механизм и применение в молекулярной биологии вирусов

    (±)- РНК-содержащие вирусы 

    Наконец, реовирусы содержат в качестве генома около 10 различных двухцепочечных молекул РНК, которые можно обозначить как (±)-РНК.

    Принцип репродукции этих вирусов такой  же, как если бы геномом явялялась  двухцепочечная ДНК. Только ключевым ферментом  является РНК-синтетаза.

    Неоднократно  транскрибируя (-)-цепи (±)-РНК, данный фермент образует (+)-цепи, выступающие в качестве мРНК. А для накопления новых двухцепочечных молекул (±)-РНК, очевидно, необходимо использование в качестве матрицы обеих цепей вирусной РНК.

3. Применение обратной  транскрипции в  молекулярной биологии  вирусов

    Значение  для вирусов

    Обратная  транскрипция необходима, в частности, для осуществления жизненного цикла ретровирусов, например, вирусов иммунодефицита человека и T-клеточной лимфомы человека типов 1 и 2. После попадания вирусной РНК в клетку обратная транскриптаза, содержащаяся в вирусных частицах, синтезирует комплементарную ей ДНК, а затем на этой цепи ДНК, как на матрице, достраивает вторую цепь.

    Значение  для эукариот

    Ретротранспозоны эукариот кодируют обратную транскриптазу, которая используется ими для встраивания в геном хозяина подобно тому, как это происходит у вирусов.

    Роль  в генетической инженерии  и молекулярной биологии

    В генетической инженерии обратную транскриптазу используют для получения кДНК — копии эукариотического гена, не содержащей интронов. Для этого из организма выделяют зрелую мРНК, кодирующую соответствующий генный продукт (белок, РНК) и проводят с ней в качестве матрицы обратную транскрипцию. Полученную кДНК можно трансформировать в клетки бактерий для получения трансгенного продукта.

    Обратная  транскриптаза (ревертаза) является РНК-зависимой ДНК полимеразой и используется для синтеза первой цепи комплиментарной ДНК с одноцепочечной РНКматрицы. Для инициации реакции необходим олигодезоксинуклеотид (специфический или случайный  праймер). Особенностью ревертазы является ее способность после завершения синтеза молекулы кДНК нематрично присоединять к 3'-концу первой цепи кДНК несколько дезоксинуклеотидов (преимущественно G или C), что позволяет использовать первую цепь для синтеза полноразмерных библиотек кДНК и клонирования 5'-концов кДНК (5'-RACE).

    ПЦР с обратной транскрипцией (для  получения кДНК) 

    Исходным  материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК, которую затем используют в ПЦР. Такое исследование получило название метода ПЦР с обратной транскрипцией.

    За  создание метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) Керри Мюллису в 1993 году была присуждена Нобелевская премия.

    ПЦР позволяет найти в исследуемом  клиническом материале небольшой  участок генетической информации (несколько  десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю.

    Метод включает несколько этапов: расплетание  двойной спирали ДНК, расхождение  нитей ДНК и последующее комплементарное  дополнение (достройку) обеих с помощью  специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках.

    Для проведения такого процесса используют две генетические пробы (праймеры), которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры - это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рисунке 5. 

    

    Рисунок 5. Схема полимеразной цепной реакции 

    Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100 град. С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые "стартовые" участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент - Taq-полимераза, устойчивая к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100град.С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция ПЦР.

    В результате такого "тиражирования" за 2-3 часа количество копий фрагмента  ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 10⁶ копий фрагмента. Такого количества ДНК достаточно, чтобы визуально регистрировать с помощью простых приемов, которые давно используются молекулярными биологами.

    Метод амплификации ДНК с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) оказал революционное влияние на генодиагностику. Для использования метода необходимо знать последовательность нуклеотидов на исследуемом участке ДНК.

    Поскольку ДНК-полимераза не способна сама начать репликацию и может только достраивать комплементарную цепь к уже имеющемуся двухцепочечному участку, то сначала синтезируют два олигонуклеотида (так называемых праймера), комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, обычно отстоящих друг от друга на несколько сотен пар нуклеотидов. Праймеры инкубируют с ДНК, намеченной для амплификации, и ДНК-полимеразой, которая, как известно, синтезирует комплементарные цепи в направлении 5'-3'. Специфичность реакции зависит от правильного выбора праймеров.

    В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов по С происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов по С - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса по С - синтез цепей ДНК.

    В реакции используют термостойкую ДНК-полимеразу, которая не теряет активности в течение  всей процедуры.

    После ряда таких циклов, обычно 20-30 и более, образуются сотни тысяч копий исходной последовательности, расположенной между праймерами. Метод настолько чувствителен, что его можно использовать, например, для амплификации и анализа единственного участка ДНК из одного сперматозоида человека.

    Для ПЦР пригоден минимально обработанный исходный биологический материал, даже частично разрушенный, что позволяет  исследовать цельную кровь, пятна  высохшей крови, смывы из ротовой  полости, старые срезы ткани и  другие образцы. Исходным материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК , которую затем используют в ПЦР, - так называемый метод ПЦР с обратной транскрипцией .

    Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

    - расщепления рестриктазами; 

    - гибридизации с аллель-специфическими  олигонуклеотидными зондами;

    - определения нуклеотидной последовательности;

    - исследования экспрессии in vitro с  целью поиска мутаций, укорачивающих  молекулу белка. 

    Различные модификации метода применяются  для:

    - синтеза одноцепочечной ДНК путем  изменения соотношения олигонуклеотидных праймеров;

    - создания рекомбинантных ДНК; 

    - исследования мутагенеза клонированной  ДНК; 

    - сравнения экспрессии разных  аллелей; 

    - выявления редких нуклеотидных  последовательностей или ДНК  возбудителей инфекции.

    ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.

    Принцип ПЦР заключается в чередовании  циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает нескольких миллионов.

    Для определения продукта реакции, как  правило, используют хемилюминесценцию.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    Заключение

    В заключении хотелось бы отметить, что открытие фермента ревертазы и процесса обратной транскрипции – большое событие не только в генетике, но и молекулярной биологии вообще. Прежде всего оно внесло изменение в формулировку основного постулата в молекулярной биологии: ДНК®РНК®белок. В связи с тем, что первый этап процесса передачи наследственной информации оказался в некоторых случаях обратимым, теперь эта формулировка приняла такой вид: ДНК«РНК®белок.

    Открытие  процесса обратной транскрипции не поколебало основного генетического постулата матричной теории наследственности, а лишь уточнило его. Оказалось, что в редких, особых случаях РНК может служить матрицей для ДНК. Но генетическая информация всегда сначала переписывается на РНК, а затем переводится (транслируется) на аминокислотную последовательность белков. С белков в нуклеиновые кислоты  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    Список  терминов и определении 

    ДНК (дезоксирибонуклеиновая  кислота) – молекула наследственности, которая содержит весь набор генов организма;

    РНК (Рибонуклеиновая кислота) - молекула, аналогичная по структуре ДНК, переносящая генетическую информацию от ДНК в другие части клетки и контролирующая некоторые внутриклеточные химические процессы;

      Белок (протеин) - крупная молекула, состоящая из одной или более цепочек более мелких молекул, называемых аминокислотами. Белки необходимы для построения, функционирования и регулировки клеточной структуры, тканей и органов. Примеры белков - гормоны, энзимы и антитела;