Обратная транскрипция: значение, механизм и применение в молекулярной биологии вирусов

    Важной  составной частью исследований по обратной транскрипции было развитие исследований по ретровирусологии. Учитывалось, что выяснение молекулярных основ трансформирующего действия ретровирусов на клетки представляет большой теоретический интерес и может иметь также непосредственное практическое значение для онкологии.

    В последнее время для онковирусологических исследований первостепенную важность приобрели методы генетической инженерии, так как они позволяют осуществлять размножение определенных участков геномов ретровирусов и клеток, имеющих отношение к трансформации. При обратной транскрипции РНК вируса саркомы мышей во вскрытых вирусных частицах были получены двутяжевые молекулы ДНК, содержащие ген, ответственный за трансформацию (онкоген) этого вируса. Синтезированный фрагмент был введен в бактериальную плазмиду, и были получены рекомби-нантные молекулы ДНК, которыми трансформировали клетки бактерий. В результате удалось выделить клоны Е. coli, содержащие онкоген. ДНК полученного клопа использовали в радиоактивной форме для поиска клона бактериофага лямбда, содержащих встроенные фрагменты клеточного генома, родственные онкогену. Такие клоны удалось обнаружить в коллекции (библиотеке) емкостью 1 млн. клонов, содержащих гены человека. Клоны, содержащие нуклеотидные последовательности вирусов лейкоза и саркомы мышей, были найдены также в библиотеке генов крысы, извлечены и картированы. Обнаружены клеточные онкогены человека и крысы, гомологичные онкогену вируса саркомы мышей, создана база для выяснения возможной роли этих онкогенов в возникновении рака у человека.

    Большое внимание привлекал вирус лейкоза крупного рогатого скота, так как заболевание, вызываемое этим вирусом, причиняет серьезные убытки животноводству. Вирус лейкоза был получен в высокоочищенном состоянии и в значительных количествах; изучены его физико-химические свойства, выделена и охарактеризована ревертаза этого вируса.

    Значительные усилия были направлены на изучение диагностики предлейкозного состояния животных. Были отработаны и проверены при массовых испытаниях два количественных теста — по ревертазной активности и иммунохимический. Полученные результаты дают основания для внедрения в ветеринарную практику этих новых приемов диагностики. Предложен новый метод определения ревертазной активности; без применения радиоактивных изотопов, что сделает возможным его массовое использование.

    В конце 1997 г. в журнале «Nature» была опубликована работа группы Ролфа Цинкернагеля (Zinkemagel) из Цюриха, в которой показано, что в некоторых клетках животных, содержащих обратную транскриптазу ретровирусов, могут образовываться ДНК-копии других РНК-содержащих вирусов. Это захватывающее открытие означает, что обратная транскриптаза, кодируемая ретровирусами, потенциально способна делать копии ДНК с других молекул РНК, присутствующих в клетке. Значит, возможно образование свободных ДНК-копий (их называют кДНК, или ретротранскрипты) собственных генов по матрице мРНК. Эта идея, допускающая теоретическую возможность передачи генетической информации от сомы к зародышевой плазме (о чем и говорил Тед Стил еще в 1979 г.), приблизила нашу теорию об эволюции иммунной системы позвоночных к реальности.

    В практике генной инженерии широко распространен метод искусственного получения генов, основанный на их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции. Этот механизм связан с активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы — фермента, с помощью которой, можно синтезировать практически любой индивидуальный ген в присутствии соответствующих иРНК, методы выделении которых достаточно разработаны.

    Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

    1) ДНК-полимеразной, использующей в  качестве матрицы как РНК, так  и ДНК; 

    2) активностью РНКазы Н, гидролизующей  РНК в составе гибрида РНК - ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

    3) ДНК-эндонуклеазной активностью. 

    Первые  две активности необходимы для синтеза  вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК  в геном клетки-хозяина. Очищенная  обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

Рисунок 3. Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК 

    Обратную  транскриптазу преимущественно  используют для транскрипции матричной  РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, — химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера.

    Матрицей  служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.  

    2. Механизм обратной  транскрипции

    Основной  подход к исследованию мРНК базируется на методе обратной транскрипции (рис. 2), происходящем из открытия Д. Балтимором, Р. Дульбекко и Г. Теминым явления обратной транскрипции у вирусов. Ими был описан фермент обратная транскриптаза, который, используя молекулу РНК в качестве матрицы, строит вторую, комплементарную, цепь, но уже ДНК. Такая одноцепочечная комплементарная ДНК получила название кДНК (cDNA). Лабораторными методами эту кДНК можно «умножить» в миллионы раз и сохранить для последующего анализа. На методе обратной транскрипции базируются многие современные методы исследования для анализа клеточной системы транскрипции-трансляции.

Рисунок 4. Схема обратной транскрипции

Однако  тут есть один нюанс — чтобы обратная транскрипция началась, нужна короткая стартовая «затравка» (праймер), которая была бы комплементарна 3’-концу РНК (см. рис. 4). До сегодняшнего дня в качестве универсального праймера в основном использовался олигонуклеотид поли(Т), комплементарный поли(А)-хвосту. Теперь, когда оказалось, что поли(А)-хвост не столь уж инвариантен, возникает вопрос: является ли «универсальный» поли(Т)-праймер настолько уж универсальным? В свете описанного открытия, возможно, он может не связываться и не выявлять целые пулы мРНК с уридинами на 3’-конце, которые оказываются фактически «невидимыми» для традиционных алгоритмов в молекулярной биологии. А если учесть, что метод обратной транскрипции на основе поли(Т) и последующая ПЦР-диагностика являются сейчас основными инструментами для определения экспрессии генов, открытие альтернативных 3’-концов может вызвать необходимость пересмотреть истинность целых массивов данных, которые сегодня считаются исходной базой для молекулярных исследований.

    Как известно, у многих вирусов геномом  служит не ДНК, а РНК (это т.н. РНК-содержащие вирусы). Для репликации таких геномов  используются две ферментативные системы.

    В одних случаях (у ретровирусов, в т.ч. вируса СПИДа  некоторых онкогенных вирусов) это обратная транскриптаза, или РНК-зависимая ДНК-полимераза. Она последовательно катализирует три процесса:

    1. Синтез (-) -  цепи ДНК на вирусной (+)- РНК как на матрице;

    2. Разрушение вирусной РНК в составе образовавшегося гибрида РНК-ДНК;

    3. Синтез (+) - цепи ДНК на (-)- цепи  с образованием двухцепочечной  ДНК.

    Последняя обычно интегрируется в геном  хозяйской клетки и служит матрицей для синтеза вирусных мРНК РНК  полимеразной системой. Так что синтез РНК здесь происходит обычным способом.

    Более распространен иной способ репликации РНК-содержащих вирусов. При нем  используется другой фермент – РНК-синтетаза (или РНК-зависимая РНК-полимераза). Здесь на вирусной РНК как на матрице  синтезируется не ДНК, а РНК. Причем это происходит в цитоплазме зараженной клетки: в одних случаях – вне вирусной частицы, в других – внутри таковой.

    Механизм  процесса во многом сходен с механизмом РНК-полимеразной реакции: субстратами  служат рНТФ; синтезируемая цепь антипараллельна и комлементарна матричной, а растет в направлении 5¢®3¢ (следовательно, матричная цепь считывается в направлении 3¢®5¢).

    При всем при этом в разных вирусах  с РНК-синтетазным механизмом репликации используются несколько отличающиеся схемы. Это, главным образом, зависит от того, какая именно РНК служит в качестве генома. 

    (+)- РНК-содержащие вирусы, использующие РНК-синтетазу 

    В пикорновирусах содержится т.н. (+)- РНК. Это значит, что она может непосредственно использоваться в трансляции как мРНК.

    Внутри  вирусной частицы РНК не ассоциирована  с белком. Поэтому после того, как вирус попадает в клетку и  теряет свою оболочку, его РНК становится доступной для связывания с нею  рибосом клетки.

    При этом образуется единая полипептидная  цепь, которая затем расщепляется на 7 вирусных белков. Шесть из них затем войдут в состав новых вирусных частиц, а седьмой белок – фермент РНК-синтетаза, отсутствующий в вирусных частицах.

    Таким образом, репликации вирусной РНК может  начинаться только после ее трансляции и накопления какого-то количества РНК-синтетазы.

    Сама  же репликация идет в два этапа. На первом этапе на (+)- РНК как на матрице образуются (-)- цепи РНК,  на втором этапе эти  (-)- цепи РНК служат матрицей для синтеза (+)- цепей РНК, идентичных вирусным.

    Эти вновь образованные  (+)- цепи РНК могут использоваться по трем направлениям:

    - в трансляции (как мРНК) для образования  вирусных белков;

    - в репликации – для образования  новых цепей РНК;

    - в сборке (вместе с вирусными  белками) новых вирусных частиц. 

    (-)- РНК-содержащие вирусы 

    Другие  вирусы (например, рабдовирусы и  парамиксовирусы) содержат (-)- РНК, к трансляции не способную. Вместо трансляции она участвует (как матрица) в транскрипции – образовании пяти моноцистронных (+)- РНК, которые и выступают впоследствии в качестве мРНК. Процесс катализируется РНК-синтетазой, содержащейся в вирусной частице.

    В связи с иной биологией вирус  имеет и иную, более сложную, организацию. В частности, (-)- РНК упакована с помощью белков в т.н. нуклеокапсид, в составе которого остается и после проникновения вируса в клетку.

    Среди белков нуклеокапсида находятся  два фермента – разновидности  РНК-синтетазы. Один фермент осуществляет уже упоминавшуюся транскрипцию (-)- РНК. Образующиеся при этом вирусные пре-мРНК подвергаются созреванию: у них формируются «колпачки» и поли (А)-фрагменты. Вероятно, лишь после этого мРНК покидают матричный нуклеокапсид и связывается с рибосомами зараженной клетки.

    В какой-то момент нуклеокапсид перключается на другой процесс – репликацию. Возможно, это достигается путем модификации ферментов или всего нуклеокапсида. Как бы то ни было, репликация осуществляется другой разновидностью РНК- синтетазы.

    Процесс вновь включает 2 этапа:

    - образование на (-) -цепи как на  матрице (+) -цепи РНК и

    - образование на (+)-цепи как на матрице (-)-цепей РНК.

    Новосинтезированные (-)-РНК покидают нуклеокапсид и объединяются с новосинтезированными же вирусными  белками в новые нуклеокапсиды.