Обратная транскрипция: значение, механизм и применение в молекулярной биологии вирусов

 
 
 
 
 
 
 

    РЕФЕРАТ: 

Обратная  транскрипция: значение, механизм и применение в молекулярной биологии вирусов 
 
 
 
 
 
 

Выполнила:

. 

Проверил: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ОГЛАВЛЕНИЕ 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    Введение

    За десять лет после открытия структуры ДНК и расшифровки генетического кода сформулированная Джеймсом Уотсоном в 1952 г. гипотеза об однонаправленном переносе генетической информации (от нуклеиновых кислот к белку и никогда наоборот) превратилась в общепризнанную «центральную догму молекулярной биологии», которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки. Эта аксиома остается в силе для всех биологических систем. Это правило переноса генетической информации составляет суть молекулярной биологии. Только один раз, в 1970 г., оно было модифицировано, когда признали существование обратной транскрипции. Впервые обратная транскрипция была обнаружена у опухолевых вирусов мышей и кур. Сейчас эти РНК-содержащие вирусы называют ретровирусами. Их инфекционный цикл хорошо изучен. Вирус проникает в клетку-мишень, и на основе своей РНК создает копию ДНК, которая встраивается в хромосому хозяина (Рис. 1).

     

    

 

    Рис. 1 Превращение РНК в ДНК с помощью транскриптазы и встраивание в геном хозяина 

    При делении клетки встроенная копия ДНК вирусного генома удваивается и передается дочерним клеткам. Таким образом, наследственный материал вируса оказывается включенным в геном клетки. Вирусная РНК может образоваться позже путем копирования встроенной ДНК. Это приведет к образованию новых инфекционных вирусов.

    В 1970 году Howard Temin и David Baltimore независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена.

    В общем виде идею обратной транскрипции Тёмин высказал еще в 1964 г., работая к тому времени несколько лет под руководством своего учителя Р. Дульбекко с опухолеродными вирусами животных, но она была решительно отвергнута, так как считалось, что в природе не существует фермента, способного осуществить такой процесс. В 1970 г. Тёмин (одновременно независимо от него Д. Балтимор) экспериментально обнаружил такой фермент — ревертазу, фермент класса трансфераз, осуществляющий синтез молекулы ДНК на РНК как матрице. Одновременно Тёмин (и независимо от него Р. Дульбекко) выдвинул вскоре подтвержденную экспериментами теорию провируса — генома вируса, который полностью объединен с генетическим материалом клетки-хозяина в единую молекулу ДНК, что делает возможным перерождение нормальной клетки в раковую. Тем самым концепция обратной транскрипции была окончательно доказана, и в 1975 г. Тёмин (вместе с Д. Балтимором и Р. Дульбекко) был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

    По общему признанию обратная транскрипция, это открытие которое относится к числу выдающихся событий в молекулярной биологии. Оно имело крупное общебиологическое значение, и его влияние испытали многие разделы биологии и медицины, такие как молекулярная биология, молекулярная генетика, вирусология,  онкология, энзимология и др. 

    1. Значение обратной транскрипции

    Обратной транскрипцией, как известно, называют синтез полинуклео-тидных цепей молекул ДНК по матрице РНК, в отличие от обычной (прямой) транскрипции, заключающейся в синтезе молекул РНК на матрице ДНК (рис. 2).

    

 

    Рисунок 2. Синтез молекул РНК на матрице ДНК 

    Обратная транскрипция катализируется особым ферментом, который находится в составе РНК-содержащих опухолеродных вирусов, именуемых, по современной терминологии, ретровирусами. Фермент, осуществляющий обратную транскрипцию, получил название РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы, а по предложению академика В. А. Энгельгардта ему было дано короткое наименование — ревертаза.

    Вскоре же после обнаружения ревертазы в составе ретровирусов стало очевидно, что это открытие имеет по крайней мере три существенных аспекта. Во-первых, выяснилось, что прочно утвердившийся центральный постулат молекулярной биологии, коротко записываемый как цепочка ДНК →РНК → белок, нуждается в существенном дополнении: между первыми двумя членами этой триады необходимо добавить еще одно направление передачи генетической информации и записать всю цепочку в виде ДНК = РНК → белок. Во-вторых, присутствие ревертазы в составе ретровирусов сразу же указало на биологическую роль этого фермента в переписывании генетической информации ретровируса из РНК- в ДНК-форму. ДНК, синтезированная путем обратной транскрипции по РНК вируса, может служить в свою очередь матрицей для ДНК-зависимого синтеза ДНК. Тем самым информация может перейти в форму двойной нити ДНК, которая именуется провирусом. Провирус взаимодействует с генетическим аппаратом клетки, в результате чего происходит воссоединение (интеграция) геномов клетки и вируса. Такая интеграция — необходимое звено в размножении ретровирусов и в превращении нормальной клетки в  трансформированную.  Наконец,  в третьих,  ревертаза  обладает замечательной способностью использовать любые РНК в качестве матриц при наличии подходящей затравки. Поэтому открылся принципиально важный путь превращения любых РНК в ДНК-форму, то есть путь синтеза генетического материала вне клеток, в пробирке, «синтез генов».

    Таким образом, обратная транскрипция положила начало двум совершенно новым направлениям в биологии: с одной стороны, изучению детальных механизмов размножения опухолеродных вирусов и их трансформирующего действия на клетки, а с другой — получению генетического материала любой заданной специфичности, а это незаменимый инструмент исследования для широкого круга вопросов не только молекулярной биологии, но и молекулярной генетики, биологии развития, эмбриологии и др. От синтеза генетического материала в однотяжевой форме существует путь к получению двутяжевой формы ДНК, а следовательно, сочетание обратной транскрипции и репликации позволяет получать фрагменты ДНК, в том числе структурные гены и в принципе даже полные гены, включающие регуляторные участки, которые можно размножить методами генетической инженерии.

    Все эти перспективы, открывшиеся перед  молекулярной биологией, были достаточно быстро осознаны представителями молекулярной биологии, и в ряде стран началась широкая, интенсивная работа.

    В 1971 г. академик В. А. Энгельгардт выдвинул идею организации особого международного научного проекта для целенаправленного развития исследований по обратной транскрипции на основе единой согласованной научной программы. К сотрудничеству были привлечены академии наук Германии и Чехословакии.

    Развитие  работ по обратной транскрипции требовало  согласованных усилий представителей разных научных дисциплин — молекулярных биологов, энзимологов, вирусологов, химиков-органиков, генетиков, онкологов.

    Чтобы дать представление о характере  этих работ, следует хотя бы коротко  упомянуть некоторые полученные результаты.

    В 1976 г., вскоре после работ американских и швейцарских исследователей, участники проекта по изучению обратной транскрипции синтезировали с использованием ревертазы структурные гены глобинов. Затем синтезированные гены были использованы для получения рекомбинантных молекул ДНК, которые в свою очередь после введения в бактерии были размножены. Этот общий подход к синтезу генов и их размножению методами генетической инженерии был разработан на генах белков-глобинов, а затем использован для генов иммуноглобулинов мышей, инсулина рыб и др. Подобные исследования весьма важны. Некоторые полученные рекомбинантные ДНК — весьма ценные инструменты исследования, другие — имеют большое практическое значение.

    В 1974 г. впервые удалось показать, что  короткие (8—9-членные) олигодезоксирибонуклеотиды, полученные в результате органохимического синтеза, могут быть эффективными и избирательными «фазовыми» затравками обратной транскрипции, если они по своей нуклеотидной последовательности комплементарны определенному участку РНК-матрицы. Важность этой универсальной системы обратной транскрипции состоит в том, что с определенных, заранее выбранных участков молекул РНК можно получать фрагменты ДНК, однородные по своей структуре. Способ инициации обратной транскрипции с помощью фазовых затравок лег в основу метода расшифровки первичной структуры РНК, основанного на том, что аналоги субстратных нуклеозидтрифосфатов под действием ревертазы включаются в растущую цепь ДНК, однако они лишены З'ОН-группы, и из-за невозможности присоединить очередной нуклеотид синтез обрывается. При подборе определенных концентраций субстратов и аналогов синтез останавливается статистически, то есть образуется набор фрагментов ДНК, оканчивающихся одинаковым нуклеотидом. Если образующиеся фрагменты ДНК разделить электрофорезом в полиакриламидном геле, то затем легко определить расстояние от 5'-конца фрагмента до данного З'-концевого нуклеотида непосредственно на радиоавтограмме геля. Если продукт синтеза подвергнуть химической модификации, приводящей к раскрытию вторичной структуры, то распределение полос на геле становится гораздо более отчетливым и полным. Это значительно ускоряет анализ и делает его более надежным.

    Ясно, что при обратной транскрипции важная роль принадлежит олигонуклеотидной затравке, без которой многие исследования делаются невозможными. Поэтому большое значение имела успешно проведенная работа по твердофазному синтезу олигодезоксирибонуклеотидов любого заданного строения. Твердофазный метод позволяет резко сократить продолжительность синтеза (например, для синтеза декануклеотида традиционным методом требуется несколько месяцев, а твердофазным — две недели). Второе преимущество состоит в том, что открывается прямой путь к автоматизации синтеза, к созданию специальных приборов — «синтезаторов». Помимо синтеза затравок этот метод используется для синтеза особых «линкеров», нужных для получения рекомбинантных молекул ДНК.

    В результате детального анализа механизма обратной транскрипции, удалось установить, что в начале синтеза главную роль играет не двуспиральный комплекс матрица—затравка (как предполагали некоторые исследователи), а З'ОН-группа, расположенная на определенном расстоянии от полинуклеотидной цепи матрицы. При удлинении цепи в ходе синтеза было обнаружено новое, весьма своеобразное явление: ревертаза может вести синтез непрерывной цепи ДНК даже в том случае, когда в полинуклеотидной цепи матрицы имеется перерыв ковалентной структуры. Возможно, что способность ревертазы переходить с одной матрицы на другую без перерыва в цепи синтезируемой ДНК — это специальное приспособление для синтеза провирусной ДНК при попадании ретровирусов в клетки.

    Как уже упоминалось, фермент ревертаза  входит в состав ретровирусов. В  нормальных клетках также обнаруживаются ферменты, имеющие ревертазоподобную активность, однако они представляют собой либо обычные клеточные ДНК-полимеразы, либо происходят от ретровирусов. Уже давно в работах одного из первооткрывателей ревертазы X. Темина было высказано предположение о существовании обратной транскрипции в нормальных клетках, однако до сих пор этот вопрос остался невыясненным.

    При тщательном изучении препарата ДНК-полимеразы из кишечной палочки обнаружили фракцию, обладающую РНК-зависимой ДНК-полиме-разной активностью, полностью отделимую от обычной ДНК-зависимой активности. Ряд свойств новооткрытого фермента резко отличает его от обычной ДНК-полимеразы, поэтому можно думать, что это отдельный, самостоятельный белок, а не часть какого-либо другого фермента. Весьма интересно, что количество бактериальной ревертазы при переносе с бедной среды на богатую в клетках кишечной палочки значительно возрастает, то есть индукция, сопровождающаяся активацией синтеза РНК и белков, активирует и ревертазу. Еще не известно, какие функции в нормальной бактериальной клетке выполняет этот фермент. В последнее время удалось обнаружить, что при индукции ферментов в клетках животных, по-видимому, наблюдаются сходные явления, то есть не исключено, что и в клетках эукариот при определенных состояниях может существовать обратная транскрипция, не связанная с размножением ретровирусов.