Культивирование вирусов

Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный  мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

 Индикацию вирусов  в курином эмбрионе осуществляют  на основании специфических поражений  оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА.

 

Культивирование вирусов в культуре клеток.

 

Клетки, полученные из различных  органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде (`матрасы', флаконы, пробирки и др.). Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению. В зависимости от техники приготовления различают три вида культур клеток:

- однослойные - клетки, способные прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя;

- суспензионные - клетки, размножающиеся во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании;

 -органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются ограничено).

По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяются на:

- первичные, способные размножаться только на первых генерациях, т.е. в нескольких пассажах после выделения из тканей;

 -перевиваемые, или стабильные, способные размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок посредством постоянного пассирования;

- полуперевиваемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40 - 50 пассажей).

К полуперевиваемым культурам  относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную  систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор  хромосом. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

 Для выращивания  вирусов можно использовать культуры  тканей любого типа. Доза заражения  зависит от цели и назначения  опыта. Тканевые культуры используют  для выделения новых малоизученных  вирусов, когда обычным методом (заражение животных, куриных эмбрионов) невозможно установить вирусную природу возбудителя. Выбор клеточных культур определяется их чувствительностью к отдельным группам вирусов.

 Различают острую  и хроническую инфекции. Острое  течение инфекции характеризуется цитопатическим действием (деструктивными изменениями зараженных клеток, завершающихся их гибелью). Хроническая форма репродукции вируса не вызывает быструю гибель клеток, они долгое время остаются жизнеспособными и внешне могут не отличаться от зараженных.

Приготовление первичной  культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчение  ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии  изолированных клеток от трипсина с  последующем суспендированием клеток в питательной среде.

Перевиваемые однослойные  культуры клеток приготавливают из злокачественных  или нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К  ним относятся злокачественные клетки HeLa , первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep - 3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.

 

Использование клеточных культур.

Массовое культивирование  клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Продукты биотехнологии

Промышленным методом  из культур клеток получают такие  продукты, как ферменты, синтетические  гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Тканевые культуры.

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно  определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее  время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом  вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

 

 

 

 

 

 

Список литературы

Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983, 263 с.

Вирусология. Методы. / Под ред. Б. Мейхи. - М.: Мир, 1988, 344 с.

Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976, 224 с.

Дьяконов Л. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г. Ф., Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 часть, 91 с.

Животная клетка в культуре  под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000

Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.

Руководство по ветеринарной вирусологии. / Под ред. В. Н. Сюрина. - М.: Колос, 1965, 687 с.

Сергеев В. А. Репродукция и выращивание  вирусов животных. - М.: Колос, 1976, 303 с.

Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С., Сэмбрук  Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных. - М.: Мир, 1977, т. 1, 447 с.

Интернет портал Wikipedia.com.