Культивирование вирусов

Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.

 

Получение монослойных  перевариваемых культур клеток.

Одним из методов получения  перевиваемых клеточных линий является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по небольшим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4°.

Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37°.

По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию.

В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре монослоя или между  стянутыми его участками появляются округленные клеточные элементы, из которых постепенно формируются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напоминающие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтому обязательным условием при смене питательной среды является поддержание ее постоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются крупные полигональные клетки с длинными отростками.

Возникшие в процессе отбора атипичные  клеточные элементы должны быть отделены от остальных участков монослоя и  перенесены в отдельные пробирки или матрасы. Для этого может быть использован метод версенизации или механический откол атипичных клеток с помощью бактериологической петли или шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с культурой клеток почек обезьяны, где колонии атипичных клеток плотно прикреплены к стеклу и сами от него не отделяются.

При смене питательной среды  в случае появления атипичных  клеток рекомендуется осторожно  удалить большую часть ростовой среды, а меньшей частью энергично  отполоскать монослой и эту среду разлить по пробиркам. В этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающие способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.

После переноса культуры атипичных  клеток в новую посуду наблюдение за основной культурой целесообразно продолжить, так как процесс выведения новой клеточной линии весьма сложен, и далеко не всегда отобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемых клеток. Необходимо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий, продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась с одними и теми же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.

Известны такие первичные культуры, как культура клеток почки золотистого  хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).

 

Роллерное культивирование  клеток.

 

До недавнего времени  тканевые культуры применялись в  вирусологии преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот

 

метод выращивания клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, более выгодны роллерные культуры, которые экономичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.

Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной. "Урожайность" клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого применяли различного характера основы с большой удельной поверхностью: твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д. Широкого распространения эти методы не получили, так как значительно затрудняли манипуляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С. Ратнером и В. А. Крикуном методику многоярусного культивирования. Клетки культивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальными стеклянными трубками, расположенными параллельно продольной оси сосудов. Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойными культурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2 этапа. На первом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с целью равномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись к стеклу, культивирование продолжалось в стационарном положении. Описанная культуральная система была успешно использована для культивирования вируса ящура.

 

 

Культивирование клеток на микроносителях.

В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до                 50 см2/мл.

Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице.

Основными преимуществами этого метода являются:

1) создание равномерных  условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.); 2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл; 3) культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4) введение постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7) возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах; 8) возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками; 9) возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя.

Выращивание вирусов  в культурах клеток.

В настоящее время для выделения и размножения вирусов животных используются первичные культуры, штаммы клеток и установившиеся клеточные линии. В общих чертах процедура оказывается одинаковой для всех вирусов.

Среду удаляют с клеточного монослоя и монослой промывают сбалансированными буферными солевыми растворами (СБСР) или фосфатно-солевым буфером (ФСБ) для удаления ингибиторов (антител), которые могут присутствовать в среде. Вирусные частицы суспендируются в небольшом количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются клетками в течение 30 - 60 мин. После этого солевые растворы заменяются свежей средой.

Заражение вирусами культивируемых клеток вызывает характерные морфологические  изменения клеток. Конечные дегенеративные клеточные процессы (цитопатогенный эффект, ЦПЭ) обнаруживаются только через несколько недель роста в присутствии вирусов, но в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются уже через 12 ч. Детали морфологических изменений оказываются различными в случае разных вирусов.

Если вместо продуктивной инфекции вирус вызывает клеточную трансформацию, то это также сопровождается характерными изменениями морфологии и особенностей роста клеток.

Предосторожности  при работе с зараженными вирусами клетками.

Вирусы оказывают цитопатогенное действие и служат этиологическими  агентами при многих заболеваниях человека и животных. Кроме того, многие вирусы (например, онкорнавирусы, вирус герпеса тип II, аденовирусы, вирус полиомы и SV40) являются, по-видимому, агентами, вызывающими развитие опухолей у животных.           Из-за способности вирусов проходить через бактериальные фильтры бывает трудно исключить вирусы из культур незараженных клеток при наличии вирусных суспензий, когда возможна передача вируса через воздух культуральной комнаты.

Меры предосторожности-

Для заражения клеток и роста зараженных вирусами клеток должна использоваться специальная комната или группа комнат.

Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не будучи заключены в плотно закрывающиеся контейнеры. Следует принимать меры предосторожности, чтобы наружные поверхности этих контейнеров не были загрязнены вирусными частицами.

При работе с вирусами должны быть использованы специальные  защитные одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна помещаться в специальный бак для автоклавирования.

Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами, должны быть обработаны хлоросом; только после этого их можно выносить из помещения, предназначенного для работы с вирусами.

Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специальный  бак для автоклавирования.

Оборудование для хранения и обработки вирусного материала  должно размещаться внутри помещения  для работы с вирусами.

Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми автоклавами, чтобы сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.

 

Культивирование вирусов в организме лабораторных животных.

 

Выбор экспериментальных  животных определяется целью работы и видовой чувствительностью  к изучаемому вирусу. Для заражения  используют обезьян, кроликов, морских  свинок, хомячков, белых крыс и мышей.

 Лабораторных животных  заражают различными способами  в зависимости от тропизма  вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования  нейротропных вирусов заражение  производят преимущественно в  мозг (вирусы бешенства, клещевого  энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение.

 При первичном заражении  животные могут не заболеть, поэтому  через 5-7 дней внешне здоровых  животных убивают, а из их  органов готовят суспензии, которыми  заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются `пассажами'.

 Индикацию, т.е.  обнаружение факта размножения  вируса, устанавливают на основании  развития типичных признаков  заболевания, патоморфологических  изменений органов и тканей  животных или положительной реакции  гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина.В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено.

 

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.

 

Большинство известных  вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Существует несколько  способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую  полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения  и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).