Контрольная работа по "Микробиологии"

Вариант 9

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ  РАБОТЕ:

1. Основные механизмы обмена генетическим материалом у бактерий (трансформация, трансдукция, конъюгация)
2. Сущность иммунофлуоресцентного метода диагностики инфекционных болезней с/х животных.
3. Биопрепараты против пастереллеза. Изготовление и контроль.
4. Описание работы ветеринарной лаборатории.

 

- 1 -

Представление о строении генетического аппарата бактерийной  клетки основано на изучении у них  механизмов генетического обмена. У  бактерий нет такого полового процесса, какой имеется у высших организмов. У бактерий обычно происходит только односторонняя передача части наследственного материала (фрагмента ДНК) от одной бактерийной клетки - донора к другой - реципиенту. При этом в клетке реципиента происходит взаимодействие между генетическим материалом донора и реципиента, которое приводит к образованию дочерних рекомбинантных клеток. Последние клетки сохраняют некоторые признаки реципиента и приобретают новые признаки, полученные от клетки донора. Механизмами такой рекомбинации, перегруппировки признаков в потомстве, т. е. изменчивости, являются трансформация, трансдукция и конъюгация.

Трансформация (превращение, перестройка) заключается в том, что некоторые бактерии при выращивании их в присутствии веществ, извлеченных из клеток родственных им видов или разновидностей, приобретают некоторые свойства последних. Пневмококки - возбудители воспаления легких - имеют несколько разновидностей. Когда к неболезнетворной бескапсульной разновидности прибавили убитые микробные тела болезнетворной разновидности, имеющей капсулу, и ввели эту смесь белым мышам, то белые мыши, вопреки ожиданию, погибли и из крови их была выделена болезнетворная капсульная разновидность. Контрольные мыши, получившие только убитые микробные тела, не заболели. Таким образом, в организме мышей неболезнетворный пневмококк приобрел свойства болезнетворного, хотя и убитого, пневмококка. Это свойство стало наследственно закрепленным. После больших исследований было найдено, что эта наследственная изменчивость была вызвана ДНК убитых микробных тел болезнетворного пневмококка. В дальнейшем такие трансформации были получены при помощи одной только ДНК, полученной из микробных тел. Так же хорошо изучена трансформация устойчивости к антибиотикам - пенициллину, стрептомицину. Если ДНК, выделенную из антибиотиков устойчивых бактерий, добавить в культуру чувствительных к антибиотикам бактерий, то в культуре под влиянием ДНК некоторое количество клеток приобретает наследственную устойчивость к данному антибиотику. Активность ДНК, измеряемая в гаммах на 1 мл среды (v=10^-6 г), оказалась чрезвычайно высокой. Показана также возможность и межвидовой трансформации. Установление генетической роли ДНК имеет общебиологическое значение, так как позволило перейти к изучению различных биологических процессов на молекулярном уровне (синтез белка, нуклеиновых кислот, кодирование и др.).

Трансдукция - наследственно закрепленная передача признаков от одной бактерийной клетки (донора) другой клетке (реципиенту), не имеющей этих признаков, при помощи умеренного фага. Так наблюдалась передача свойств разлагать некоторые сахара, образовывать жгутики, споры, устойчивость к пенициллину. Это явление оказалось довольно распространенным среди бактерий. Некоторые созревающие частицы фага захватывают небольшие фрагменты ДНК бактерий, содержащие тот или иной признак, и передают их новой бактерийной клетке - хозяину. Предполагают, что генетический материал донорской клетки частично замещается генетическим материалом умеренного фага во время его пребывания в донорской клетке и этот материал затем фагом переносится в клетку-реципиент. Одновременно трансдуцируются один, реже два тесно сцепленных признака от одной бактериальной клетки к другой.

Конъюгация  бактерий. Клетки, из которых одна удлиненная - донор, а другая круглая и более крупная - реципиент, сближаются, между ними образуется мостик, по которому генетический материал донора переходит в клетку-реципиент. Был установлен односторонний перенос генетического материала донора, обозначаемого как F⁺ (мужского типа), в клетку-реципиент, обозначаемую знаком F^- (женского типа). Клетка-донор содержит особый фактор плодовитости, обозначаемый F-фактор. При скрещивании штаммов F^- и F^- рекомбинаций не образуется, они образуются при скрещивании штаммов F⁺ и F^- с частотой около 10⁶, т. е. очень незначительной.

В дальнейшем были найдены  штаммы доноры F⁺ , которые при скрещивании с F^- образовывали рекомбинанты с очень большой частотой 10¹-10³. Такие штаммы обозначаются High, frecuency of recombination Hfr. - высокая частота рекомбинации АШ, ЭФ, ЭР. Эти штаммы очень облегчили работу по изучению конъюгации.

При конъюгации происходит медленный перенос генетических факторов бактериальной хромосомы  от донорской клетки в реципиентную в строгой последовательности их расположения в хромосоме донора. Количество перенесенных факторов зависит от продолжительности контакта клеток. Конъюгацию можно прекращать искусственно через различные промежутки времени путем встряхивания в особом смесителе, и таким образом можно определять, какие наследственные факторы и в какой последовательности расположены в хромосоме клетки. При помощи конъюгации оказалось возможным легко и более точно составить генетическую карту хромосомы бактерийной клетки.

 

-2-

       Метод иммунофлюоресценции - основан на использовании флюоресцирующей сыворотки. Антитела, находящиеся в этой сыворотке, окрашены специальным флюорохромом — флюоресцеином. На мазок из бак. культуры или препарат-отпечаток после фиксации метиловым спиртом в течение 5—10 минут наносят 2—3 капли специфической флюоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Мазок во влажной камере (чашка Петри с увлажненным ватным тампоном) на 30 минут помещают в термостат (37°). Затем препарат тщательно промывают в нескольких сменах дистиллированной  воды, высушивают на воздухе, наносят на него нефлюоресцирующее иммерсионное масло и исследуют в люминесцентном микроскопе. При наличии в мазке возбудителя антиген сыворотки соединяется с бактериями и последние начинают светиться ярко-зеленым цветом; в некоторых случаях вокруг них образуется только светящийся ободок.

Результаты исследования: сияющее зеленовато-желтоватое свечение — (++++)» яркое желтовато-зеленоватое — (+++)» умеренное желтовато-зеленоватое — (++)> слабое, слегка зеленоватое — (+)> микробные клетки в виде сероватых теней — (—). Положительным считается свечение типичных для возбудителя форм, оцениваемое не менее чем в 2 плюса при условии, что в контрольных препаратах, окрашенных неспецифической (другого вида животного) сывороткой, свечение отсутствует.

 

-3-

 

            Вакцина (лат. vacca—корова) получила свое название по противооспенному препарату, приготовленному из вируса, вызывавшего оспу у коров.

    Вакцинами называют препараты, получаемые из ослабленных, убитых возбудителей болезней или продуктов их жизнедеятельности и применяемые для активной иммунизации животных с целью специфической профилактики и терапии инфекционных болезней.

     Вакцинные  препараты подразделяют на четыре  группы:

1) вакцины из живых  возбудителей с ослабленной вирулентностью;

2) вакцины из убитых корпускулярных патогенных микроорганизмов (бактерий, риккетсий и вирусов);

3) анатоксины;

4) вакцины из продуктов химического расщепления некоторых бактерий (химические вакцины).

      К живым вакцинам относятся вакцины против сибирской язвы, туберкулеза, туляремии, бруцеллеза, и др.

Для их изготовления вначале  выделяют ослабленные по вирулентности  штаммы:

1)  – выращивание  микробной клетки в  необычных t^оС условиях.

2) - выращивание микробной клетки на  необычных питательных средах.

3) воздействие мутагенов, вызывающих мутацию с потерей вирулентности. 4) воздействие ультрафиолетовых лучей с целью ослабления.

5)многократным пассажированием вирулентных микробных клеток на слабочувствительных организмах.

Преимущества -  создание более напряженного иммунитета.

Недостатки – в  некоторых случаях (например, ослабленный  организм) вызывает осложнение.

Контроль – безвредность, иммуногенность, чистота роста.

      Для  изготовления  убитых вакцин подбирают специальные штаммы с высокими иммуногенными свойствами, накапливают на средах, собирают,  убивают нагреванием, путем обработки ультрафиолетовыми лучами, формалином. При этом клетки не разрушаются, но сохраняют антигенные свойства. Эти вакцины слабее живых, поэтому добавляют адъюванты. Контроль- безвредность, иммуногенность, чистота роста.

Преимущества – не вызывают осложнения.

Недостатки – большие  дозы, не длительный иммунитет.

Пример - вакцина против лептоспирозов и др.

 

      Анатоксины изготовляют из экзотоксинов соответствующих возбудителей путем обработки их 0,3—0,4% формалином и выдерживания при 38—40°С в течение 3—4 недель. Широкое применение имеют столбнячный анатоксин. Получены анатоксины против ботулизма, стафилококковый и анаэробной инфекции. Эти препараты выпускают в очищенном виде; их освобождают от балластных веществ и адсорбируют на гидрате окиси алюминия. Анатоксины вызывают выработку антитоксинов, которые нейтрализуют экзотоксины, но не оказывают губительного действия на возбудителей.

 

      Химические вакцины представляют собой препараты, состоящие не из цельных клеток бактерий, а из химических комплексов (детерминантных групп антигенов), полученных путем обработки взвеси культуры специальными методами. Так, например, для профилактики брюшного тифа и столбняка применяют химическую сорбированную вакцину из О- и Vi-антигенов брюшно- тифозных бактерий и очищенного концентрированною столбнячного анатоксина. Бактериальные антигены и столбнячный анатоксин адсорбированы на гидроокиси алюминия.

 

      Моновакцины -  вакцины, состоящие из одного антигена.

     Поливалентные вакцины - состоящие из нескольких щтаммов (серовариантов) возбудителя одной болезни (поливалентная против  лептоспироза;  против брадзота,  инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дезентерии ягнят и др.).

      Ассоциированные вакцины -  содержат антигены различных бактерий или неоднородные антигены (ассоциированная поливалентная вакцина против паратифа, пастеррелеза и диплококковой септицемии поросят).

      Вакцины  вводят в организм накожно,  подкожно, внутрикожно, через рот, в слизистую оболочку носа, зева; через определенный промежуток времени (от нескольких дней до нескольких недель); вакцины создают активный иммунитет. К вакцинам предъявляют весьма строгие требования. Они должны быть безвредными и высокоиммуногенными (способными вызывать прочный и длительный иммунитет).

        Вакцины изготовляют на специальных биофабриках, в производственных институтах вакцин и сывороток или отдельных лабораториях при научно-исследовательских институтах. Выпускаемые препараты подвергаются местному и государственному контролю, осуществляемому ВГНКИ.

 

 

Принципы изготовления иммунных и гипериммунных сывороток. Контроли сывороток.

        Готовят на животных путем  однократного (иммунные),  или многократного (гипериммунные) введения возбудителя. Используют для диагностики и лечения. Контроль – стерильность, безвредность, специфическая активность.

      Лечебные и профилактические  сыворотки выпускают в очищенном виде. Их обрабатывают осаждением глобулинов сульфатом аммония, фракционированием, ультрацентрифугированием, электрофорезом, ферментативным гидролизом, которые позволяют удалять до 80% балластных белков. Такие сыворотки обладают лучшими лечебными и профилактическими свойствами, содержат наименьшее количество балластных белков, оказывают менее выраженное токсическое и аллергическое действие.

      Выпускаемые сыворотки  подразделяют на антитоксические  и антимикробные. К антитоксическим сывороткам относятся противоботулиническая, противостолбнячная, против анаэробной инфекции, противозмеиная. Их назначают в соответствии с существующими инструкциями или наставлениями, дозы сывороток измеряют в международных единицах.

      Антимикробные  сыворотки применяют против ряда болезней в виде глобулинов и иммуноглобулинов (гамма-глобулины).

 

Лабораторная  диагностика пастереллеза. Характеристика возбудителя. Биопрепараты.

         Pasteurellosis (геморрагическая септицемия) — группа инфекционных болезней с/х и диких животных, а также человека, вызываемая микроорганизмами из рода Pasteurella multocida (gemolitica). При остром течении – характерна септицемия с развитием геморрагического воспаления слизистых оболочек дыхательных путей и кишечника, а при подостром и хроническом - поражение легких.

     Pasteurella multocida - бактерия - неподвижная, Гр-, спора-, капсула+. При окрашивание мазков из крови и органов выявляется биполярность. МПА – мелкие росинчатые колонии. МПБ – помутнение, слизистый осадок

     Биохимическая активность пастерелл незначительна: многие штаммы ферментируют с образованием кислот, без газа глюкозу, сахарозу, сорбит и манвит; лактозу и дульцит не изменяют; молоко не свертывают; МПЖ не разжижают; в бульоне, содержится пептон, образуют индол.

    Биопроба - белых мышей, кроликов. Кроликов  проверяют введением в течение 3 дней в каждое носовое отверстие двух капель 0,5%-ного водного раствора бриллиант-грюна. У пастереллоносителей появляется гнойное истечение из носовой полости, и при наличии вирулентных пастерелл животное погибает через 18—36 часов.

    Дифференциальная диагностика. Пастереллез необходимо дифференцировать: у телят — от сибирской язвы, пироплазмидозов, эмфизематозного карбункула, стафилококковой и стрептококковой инфекций; сальмонеллеза, колибактериоза и респираторных вирусных инфекций; у поросят — от чумы, рожи, гемофилезной плевропневмонии и сальмонеллеза; у ягнят—от сибирской язвы, пироплазмидозов, клостридиозов и стрептококковой инфекции.