Вплив лактату на активність ферментів синтезу нуклеотидів

 

Максимальне збільшення активності ферменту відбувається при концентрації лактату в кінцевій пробі 20 мМ. Активність АДА за цією концентрацією збільшується в 2,6 рази, в порівнянні з контрольною пробою яка не містить лактат (табл.2). При подальшому збільшенні концентрації лактату в досліджуваній пробі активність АДА знижується у порівнянні з пробою, де концентрація лактату 20 мМ. Але в порівнянні з контрольною пробою ми бачимо значну активацію ферменту. Мінемальне зменшення активності АДА спостерігається при концентрації 15мМ де активність ферменту майже не змінюється.

У нормі концентрація лактату в тканинах після фізичного  навантаження близько 10 мМ та трішки менша без впливу цього фактору. Тому для дослідження використовувалися дві нормальні концентрації і підвищені вдвічі та втричі задля отримання чітких результатів.

Таблиця 2.2

Вплив лактату  натрію на активність АДА в гемолізате еритроцитів здорових чоловіків

Концентрація  лактату натрія в пробі, мМ	Активність АДА в гемолізаті ерітроцитів,          нмоль/(хв*мг)
Без лактату	7,26±0,65
7,5	7,73±0,61
10	9,28±0,45
15	7,6±0,42
20	19,10±2,33
25	13,34±0,5
Концентрація  лактату натрія в пробі, мМ	Активність АДА в гемолізаті ерітроцитів,          нмоль/(хв*мг)
30	12,10±4,38

 

Ці дослідження демонструє діограма приведена на рис.2.1

 

Рис 2.1Вплив лактату на активність АДА в гемолізаті еритроцитів

 

Таким чином за допомогою цього експерименту бачимо що лактат активує АДА в еритроцитах здорових людей і максимальна активність АДА при концентрації лактату а в інкубаційної середовищі 20 мМ.

 

 

 

 

2.3 Вплив лактату на активність АДА в еритроцитах здорових.

 

Відомо, що у пухлині метаболізм відрізняється від метаболізму нормальних тканинах та інших швидкозростаючих тканин до яких відносяться ще ембріональні та регенеруючі тканини. Синтез нуклеотидів у пухлинних клітинах йде з готових блоків: з азотних основаній та фосфорібозилу пірофосфату та також з нуклеозидів. Для пухлин характерною рисою є активація аденозиндезамінази. Окрім цього аденозин індукує апоптоз, тобто запрограмовану клітинну смерть та також він викликає конденсацію хроматину та фрагментацію ядра.

Як згадувалось  раніше у клітині аніонний склад  регулюється за допомогою зовсім інших ферментів ніж катіонний. При дослідженні впливу лактату на активність АДА в еритроцитах хворих ми виявили, що лактату натрію також надає активуючий вплив на активність АДА в еритроцитах хворих на РМЗ. Примітно, що максимальний активуючий вплив лактату виявлено при його концентрації 20 мМ як і в нормі. На відміну від норми, активність ферменту в еритроцитах хворих РМЗ при даній концентрації (20 мМ) збільшується в більшому ступені в 3,3 рази. Вірогідні відмінності впливу лактату на еритроцити здорових і хворих на РМЗ виявлені тільки для концентрації лактату 15 мМ. (Табл. 2.3).

Таблиця. 2.3

Вплив лактату  натрію на активність АДА в гемолізате еритроцитів

хворих на РМЗ

Лактат натрія у пробі, мМ	Активність АДА в гемолізаті еритроцитів, нмоль/(хв*мг)
Без лактату	6,21±0,69
7,5	8,14±0,27
Лактат натрія у пробі, мМ	Активність АДА в гемолізаті еритроцитів, нмоль/(хв*мг)
10	9,62±0,41
15	11,76±0,43*
20	20,59±1,73
25	13,21±0,23
30	9,0±0,19

 

* Примітно що показники розрізняються при р = 0,03

 

Отримані результати різного впливу на активність АДА  підтверджує різний стан метаболізму нуклеотидів в організмі онкологічно хворих і здорових людей.

Таким чином можна зробити висновок що лактат надає більш виражений активуючий вплив на активність АДА в еритроцитах жінок хворих на РМЗ ніж здорових людей.

 

 

 

2.4 Вплив лактату на активність АДА у пухлинних та нормальних тканинах.

 

З метою з'ясування особливостей нуклеотидного обміну у хворих на рак ми вивчали вплив лактату натрію на активність аденозіндезамінази у тканинах. Задля дослідження було використано тканини молочної залози з вузлів пухлини і віддалені суміжні тканини які не були трансформованими. Суміжні тканини не мали ознак малігнізації. В експерименті з тканинами також були використані різні концентрації лактату натрія.

В експерименті з тканинами виявили, що лактат відіграє важливу роль у модуляції активності ферменту обміну пуринових нуклеозидів в пухлинних клітинах якими є аденозин та гуанозин. Збільшення лактату в гомогенаті пухлинних тканин до концентрації лактату 10 мМ активність АДА збільшується в 1,5 рази в порівнянні з пробою без лактату. Без лактату активність в пухлинної тканини АДА 23,7 ± 4,6 нмоль / (хв*мг). При подальшому збільшенні концентрації лактату в гомогенат пухлинної тканини дає негативні значення активності ферменту, що означає швиде використання продукта. В цьому опиті спостерігався аномальний вплив лактату на розпад пуринових нуклеотидів (Мал.3). У пухлинній тканині лактат ініціює поглинання аденозину, який є субстратом АДА і яке не супроводжується утворенням продуктів реакції (інозин), у порівнянні з нормальними суміжними тканинами.

Рис.2.2 Залежність активності АДА від концентрації лактату в пухлинних тканинах при

1 - активність  АДА при концентрації лактату  натрію 10 мМ

2 - активність  АДА при концентрації лактату  натрію 20 мМ

3 - активність  АДА при концентрації лактату натрію 30 мМ

 

Отримані дані, можливо можуть свідчити про збільшення активності ферментів, які беруть участь у перетворенні інозину наприклад пуріннуклеозідфосфорілази (ПНФ). Продуктами ПНФ - реакції є гіпоксантин і рибоза-1-фосфат, які можуть бути субстратами «запасного шляху» синтезу нуклеотидів характерного для пухлинної тканини. Можна припустити, що при додаванні молочної кислоти збільшується активність ПНФ і негативні значення, які ми реєструємо, підтверджують активне перетворення інозину.

Таким чином  у пухлинних тканинах при концентрації лактату 10 мМ ми спостерігаємо активуючий вплив на швидкість катаболізму пуринів. При 20 і 30 мМ лактату в гомогенат пухлинної тканини ми реєструємо негативні значення активності АДА. Можливо це пов'язано з активацією ферменту перетворення інозину.

У суміжної тканини  спостерігається протилежна картина. На відміну від впливу, який ми відзначили в пухлинної тканини, в суміжній тканини при збільшенні концентрації лактату до 20 мМ спостерігається  статистично достовірне збільшення активності тканинної АДА (Рис. 2.2).

Залежність  активності АДА від лактату у суміжних

тканинах при

1 - активність  АДА при концентрації лактату  натрію 10 мМ

2 - активність  АДА при концентрації лактату  натрію 20 мМ

3 - активність АДА при концентрації лактату натрію 30 мМ

 

Без лактату  активність АДА в суміжній тканині 15,6 ± 3,7 нмоль / (хв*мг). При додаванні лактату натрію до гомогенату нормальних, тобто не трансформованих тканин, 10 мМ спостерігається збільшення активності фермента в 2,3 рази, а при концентрації 20 мМ в 2,62 рази. При концетраціі 30 мМ лактату спостерігаємо зниження активності в порівнянні з пробою де концентрація була 20 мМ. Схожа картина впливу лактату отримана нами і в гемолізате еритроцитів як здорових так і хворих на РМЗ (табл.2.4 ).

Таблиця 2.4

Вплив різних концентрацій лактату на активність АДА у тканинах хворих

 

Концентрація  лактату натрія, мм	Відсоткове  збільшення активності АДА
10	230%
20	262%
30	-192%

 

Таким чином у суміжних тканинах, які не мали ознак пухлинної трансформації ми також спостерігаємо активуючий вплив лактату на активність АДА при концентрації лактату 10 мМ. На відміну від пухлинних тканин в нормальних тканинах при концентрації лактату 20 мМ ми також відзначаємо збільшення активності АДА. При подальшому збільшенні концентрації лактату до 30 мМ в суміжних тканинах відбувається зниження активності АДА.

У суміжних тканинах як і в еритроцитах ми спостерігаємо  максимальну активність ферменту при  концентрації 20 мМ.

При РМЗ в  пухлинних тканинах активність АДА без додавання лактату в 1,5 рази вище.

Було зроблено припущення, що характерна для пухлин активація гліколізу і накопичення в пухлинної тканини лактату може якимось чином впливати на швидкість обміну пуринових нуклеозидів якими є аденозин та гуанин. У цих дослідженнях активуючий вплив лактату на активність ключового ферменту обміну пуринових нуклеотидів - аденозиндезамінази. Причому, на всіх етапах експерименту визначали рН, який при додаванні різних концентрацій лактату натрію залишалася рівним 7,4. Тобто повністтю виключається вплив ацидозу. Примітно, що на нормальні і здорові тканини лактат має різний вплив де підвищує активність досліджуємого фермента АДА.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВИСНОВОК

 

Багато наукових діячів сучасності та вчених минулих  десятиріч вважають що лактат є кінцевим продуктом метаболізму та не є  особливо важливою речовиною. Проаналізувавши  літературні джерела можна стверджувати, що лактат, має в організмі важливі  різноманітні функції. Нові погляди на роль лактату пояснюють багато питань, які поставали перед вченими. Важлива роль лактату у пухлинах, де він активує синтез інтерлейкіну, виконує роль енергетичного субстрату, та впливає на активність ферментів обміну  нуклеотидів. Цікаво, що лактат – це медіатор пухлинного росту та його концентрація регулює активність гліколізу. Причини появи злоякісних пухлин різноманітні (спадкова предросположеність, ретровіруси, іонізуючі випромінювання, ультрафіолетові проміння, радон,  хімічні канцерогени та гормони і їх метаболіти), але загальні шляхи патогенезу спільні і гіперпродукція лактату один з них.

У процесі вивчення теми відповідь на ключове питання  роботи “ Чи є лактат регуляторною молекулою? ”  в сучасній науковій літературі була знайдена відповідь  “ Так ”! На сучасному етапі вивчення цієї проблеми відомо вже чотири абсолютно нові функції лактату у клітинах, у тканинах (особливо у швидкоростучих), а також у цілому організмі. Вивчивши погляди  на дану проблему передових діячів сучасної науки можна стверджувати, що ця тема є маловивченою, та  актуальною, і потребує детального подальшого вивчення.

З експерементальної частини можна зробити наступні висновки:

1) лактат надає більш виражене активуюча вплив на активність АДА в еритроцитах жінок хворих на РМЗ.

2) у пухлинних тканинах при концентрації лактату у кінцевому обсязі 10 мМ ми спостерігаємо активуюча вплив на швидкість катаболізму пуринів. При 20 і 30 мМ лактату в гомогенат пухлинної тканини ми реєструємо негативні значення активності АДА. Можливо це пов'язано з активацією ферменту перетворення інозину.

3) у суміжних тканинах, які не мали ознак пухлинної трансформації ми також спостерігається активуючий вплив лактату на активність АДА при концентрації лактату 10 мМ. На відміну від пухлинних тканин в нормальних тканинах при концентрації лактату 20 мМ ми також відзначаємо збільшення активності АДА. При подальшому збільшенні концентрації лактату до 30 мМ в суміжних тканинах відбувається зниження активності АДА.

Таким чином  відповідь на основне питання роботи: «як саме впливає аніон молочної кислоти активність ферментів нуклеотидного обміну?» була знайдена остаточна відповідь що лактат підвищує активність ключового ферменту метаболізма аденозиндезамінази.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК  ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

 

1. - Aghaei M., Karami-Tehrani F., Salami S., Atri M. Adenosine deaminase

activity in the serum and malignant tumors of breast cancer: the assessment of isoenzyme ADA1 and ADA2 activities // Clin. Biochem. - 2005. - V. 38, №10. - P. 887-891.

2. - Borzenko B.G., Bakurova E.M. [Disturbed metabolism of gastric mucosa DNA precursors as prognosticator of neoplastic transformation of gastric ulcer] // Vopr. Onkol. - 2008. - V. 54, №2. - P. 184-187.

3. -  Brooks, G. A. (2002a). Lactate shuttles in nature. Biochem. Soc. Trans. 30,

258-264.

4. - Costa L.T., Da S.D., Guimaraes C.R., Zancan P., Sola-Penna M. Lactate favours the dissociation of skeletal muscle 6-phosphofructo-1-kinase tetramers down-regulating the enzyme and muscle glycolysis // Biochem. J. - 2007. - V. 408, №1. - P. 123-130.

5. - Crabtree H.G. Observations on the carbohydrate metabolism of tumours // Biochem. J. - 1929. - V. 23, №3. - P. 536-545.

6. - Gladden L.B. 200th anniversary of lactate research in muscle // Exerc. Sport Sci. Rev. - 2008. - V. 36, №3. - P. 109-115.

7. - Gladden L.B. Lactate metabolism: a new paradigm for the third millennium // J Physiol. - 2004. - V. 558, №Pt 1. - P. 5-30.

8. - Gladden L.B. A lactatic perspective on metabolism // Med Sci. Sports Exerc. - 2008. - V. 40, №3. - P. 477-485.

9. - Ioachim E. Thymidine phoshorylase expression in breast cancer: the prognostic significance and its association with other angiogenesis related proteins and extracellular matrix components // Histol. Histopathol. - 2008. - V. 23, №2. - P. 187-196.

10. - Koukourakis M.I., Kontomanolis E., Giatromanolaki A., Sivridis E., Liberis V. Serum and Tissue LDH Levels in Patients with Breast/Gynaecological Cancer and Benign Diseases // Gynecol. Obstet. Invest. - 2008. - V. 67, №3. - P. 162-168.

11. - Liu Z.J., Peng W.C., Yang X., Huang J.F., Zhang X.B., Zhang Y., Maekawa M. Relative mRNA expression of the lactate dehydrogenase A and B subunits as determined by simultaneous amplification and single strand conformation polymorphism. Relation with subunit enzyme activity // Journal of Chromatography B. - 2003. - V. 793, P. 405-412.                                                 12.   Philps A. Lactate – a signal coordinating cell and systemic function // The Journal of Experimental biology 208, 2005, P. 4561-4575.