Вплив лактату на активність ферментів синтезу нуклеотидів

 

МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ

Всеукраїнська Мала академія наук України

Донецьке територіальне  відділення Малої академії наук України

біології, екології, хімії, аграрних наук і наук про людину відділення МАН,             м. Донецьк

 

 

секція: медицина

 

Вплив лактату на активність ферментів синтезу нуклеотидів

 

 

 

 

Науково-дослідницька робота

учениці 11 класу ЗССІЗ «Ерудит»

Бєлоусової  Катерини Миколаївни

Науковий керівник

Шатова Ольга  Петрівна

 асистент  кафедри біохімії

ДонНМУ ім.М.Горького

 

 

 

 

 

2009 рік

Зміст

 

 

Вступ           3

1. Огляд літератури         4

1.1. Історія вивчення  лактату        4

1.2. Сучасні погляди  на функції лактату в організмі  людини  5

1.3. Влив лактату  на активність ферментів нуклеотидного обміну 6

2. Практична  частина         9

2.1 Матеріали та методи дослідження      9

2.2 Вплив лактату на активність АДА в еритроцитах здорових  11

2.3 Вплив лактату на активність АДА в еритроцитах хворих на рак      14

2.4 Вплив лактату на активність АДА в пухлинних та нормальних

тканинах хворих жінок раком молочної залози     15

Висновок           20

Список використаних джерел       22

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВСТУП

 

Довгий час  вважалося, що лактат або молочна  кислота [Губський, стр. 191], що є кінцевим продуктом метаболізму окислення  глюкози в анаеробних умовах не має в організмі особливо великого значення. Це було зумовлено у більшій мірі вивченням властивостей лактату, а не його функцій. Під терміном "лактат" у біохімічній літературі [Губський, стр. 191] мається на увазі аніон молочної кислоти, що може бути пов'язаний з різними катіонами, в тому числі з катіоном водню. Виходячи з того, що катіонний склад рідин у клітині регулюється незалежно від аніонного, зазвичай найбільш вірогідний склад солі молочної кислоти не уточнюється, бо він швидко змінюється в залежності від потреб клітини. Сучасні дослідження показали, що лактат не є тупиком метаболізму. Існує декілька теорій про його значення в організмі. Одна з найцікавіших теорій про те, що лактат є регуляторною молекулою та його концентрація у тканинах може визначити малігнизується тканина чи ні. Лактат є індуктором транскрипції інтерлейкіну, відповідального за локальне запалення в оточуючих пухлину тканинах та за прогресію пухлинного росту. Зміна концентрації лактату може привести до зміни активності ферментів обміну нуклеотидів та до підсилювання  проліферативної активності. Відомо, що лактат є енергетичним субстратом та його збільшення у швидкоростучих тканинах покриває їх підвищені потреби в енергії.

Швидкий зріст  онкологічних захворювань різноманітної  локалізації за останні 10 років є гострою проблемою у медицині. Рак молочної залози (РМЗ) займає перше місце серед онкозахворюванності жінок, за останніми даними серед 10 жінок одна хвора на рак молочної залози, а серед жінок у віці 40-50 років головною причиною смерті є РМЗ. Щороку онкологічні захворювання забирають життя 30% людей в Україні та 20% у Європі від усіх померлих. Етіологія та механізми патогенезу виникнення пухлин до цього часу залишаються не вивчені. Новий погляд на роль лактату у розвитку злоякісних пухлин може бути цікавим механізмом пояснюючим розвиток злоякісних пухлин. Проблема, що  вивчається, актуальна як для медицини так і для біохімії.

Мета роботи: вивчення впливу солей молочної кислоти  на активність ферментів нуклеотидного  обміну. Під час експерименту вивчити вплив солей лактату на активність ферменту в нормі та у хворих на рак.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. ОГЛЯД  ЛІТЕРАТУРИ

 

1.1. Історія  відкриття лактату

Історія лактату  або молочної кислоти почалась з 1808 року, коли вченим Берцеліусом було встановлено збільшення лактату у м’язах оленя, який був застрелений на полюванні [8]. У наступному сторіччі було декілька досліджень, які були суперечливими та вносили плутанину у розуміння функцій лактату в організмі. Дослідження Хіллса у 1910 році довели, що лактат є безпосередньо енергетичним донором для м’язового скорочення. Дослідження Мєєргофа  (у 1920 році) продемонстрували, що глікоген є прекурсом лактату та при катаболізмі глікогену утворюється лактат. У 1920-1930 рр. відкриття фосфорилювання призвело до розуміння інших механізмів енергозабезпечення м’язової тканини. 1939 рік – це рік відкриття міозину та з 1930-1970-х років лактат вважається кінцевим продуктом метаболізму гліколітичного шляху окислення глюкози при гіпоксичному стані (Вассерман 1984 рік). На початку 70-х років почалась «лактатна революція», яка у наш час знаходиться у кульмінації. Ера «лактатнного челнока» почалась у 1984 році, коли Георг Брукс висунув гіпотезу про існування міжклітинного лактатного переносника, а потім був відкритий внутрішньоклітинний лактатний транспортер[9;11]. Ті ж самі челноки можуть виводити лактат з м’язів, але окрім цього за допомогою цих самих транспортерів лактат може поглинатися.

 

 

 

 

1.2 Сучасні  погляди на функції лактату

У наш час  існує декілька гіпотез стосовно ролі лактату в організмі:

А) Лактат  –  це регуляторна молекула [7;13;14;16]. Брукс  допустив, що лактат є псевдогормоном і бере участь у регуляції метаболізму. Гладен у своєму огляді вважає, що лактат є ключовим метаболітом, який впливає  на весь організм. Лактат регулює швидкість гліколізу, цікаво що інгібиція активності ключового лімітуючого ферменту – фосфофруктокінази (ФФК) не пов’язано зі зміною рН середовища. Лактат знижує аффиність ФФК до її субстратів - АТФ та фруктозо-6-фосфату, а також лактат сприяє дисоціації активного тетрамеру ФФК на менш активні дімери [2]. Японські вчені у 2008 році відкрили, що лактат, який утворюється пухлинними клітинами активує транскрипцію інтерлейкіну (ІЛ) 23, відповідального за розвиток пухлини та запалення в оточуючих пухлину тканинах[15].

Б) Лактат приймає  участь у репарації [3;10].Збільшення концентрації лактату (до 15 мМ, в нормі  до 2 мМ) при пошкодженні тканин призводить до збільшення продукції матричної  РНК, проколагену та відповідно до збільшення синтезу колагену. Окрім цього лактат збільшує активність ферменту пролінгідроксилази, який перетворює пролін у гідроксипролін. Гідроксипролін та гідроксилізин є специфічними амінокислотами для колагену та при порушеннях їх синтезу порушається синтез колагену. Окрім цього лактат є стимулятором ангіогенезу у рані. Лактат в макрофагах збільшує продукцію ендотеліального фактору росту судин, таким чином активує ангіогенез.

В) Лактат відповідає за редокс-потенціал клітинних мембран  та мембран органел [12].

Г) Лактат –  це енергетичний субстрат[4]. Під час активної діяльності у стаціонарному стані м’язи активно споживають лактат, як субстрат для окиснення. Серцева м’яза також використовує лактат, як енергетичну сировину. Печінка використовує лактат як субстрат для глюконеогенезу. Навіть головний мозок захоплює лактат, коли його багато у крові та використовує як енергетичний субстрат. Сучасній науці відомо що існує мітохондріальний ізофермент лактатдегідрогенази (ЛДГ) та перетворення лактату в піруват може відбуватися безпосередньо у мітохондріях[6].

 

 

 

1.3 Вплив  лактату на активність ферментів  нуклеотидного обміну

 

Цікаву роль лактат має при канцерогенезі, характерною  рисою якого є інтенсифікація гліколізу та гіперпродукція лактату  в умовах достатнього кисневого  забезпечення – ефект Варбурга-Кребтрі [5]. Одним з механізмів цього ефекту вважають активацію лактатдегідрогенази [10], у тому числі і за рахунок гіперекспресії її гена [11]. З іншого боку пухлинному росту також характерні зміни стану ключових ферментів метаболізму нуклеотидів – тімідінфосфорілази [8] та аденозиндезамінази [1].

Накопичені  дані про біохімію пухлинного росту, узагальнені, наприклад, у нещодавньому огляді [13], свідчать не лише про те, що ініціація мутагенезу та прогресування  пухлини припускає участь багатьох ферментів, в першу чергу обміну – нуклеїнових кислот, та важливої ролі ферментів гліколізу, відповідальних за забезпечення додатковою енергією високі потреби злоякісно трансформованих клітин. Злоякісні пухлини, різноманітні за гістологічною будовою, мають багато метаболічних особливостей та відмінностей, але спільною рисою неоплазм є гіперпродукція лактату й активація синтезу нуклеотидів шляхом реутилізації, який у нормальних клітинах є запасним, а у швидкоростучих тканинах стає основним. Цікавим є те, що фермент обміну пуринових нуклеотидів – аденозиндезаміназа, який каталізує гідролітичне перетворення аденозину до інозину та аміаку, в пухлиних тканинах більш активний.

Відомо, що пухлина  є «пасткою» глюкози та азоту. Синтез нуклеотидів у пухлинних  клітинах йде з готових блоків: з азотних основаній та фосфорібозилу пірофосфату та також з нуклеозидів. Для пухлин характерною рисою є активація аденозиндезамінази [1]. Окрім цього аденозин індукує апоптоз, тобто запрограмовану клітинну смерть. Аденозин викликає конденсацію хроматину та фрагментацію ядра. Цікаво, що висока активність АДА у неопластичній клітині призводить до її «безсмертя».

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.ПРАКТИЧНА  ЧАСТИНА

 

2.1 Матеріали та методи дослідження

 

Матеріал дослідження  були еритроцити, які виділяла периферичної крові тридцяти добровольців - здорових чоловіків у віці 18-25 років. Окрім цього досліджували (вплив лактату на активність АДА) еритроцити хворих жінок на рак молочної залози (РМЗ). Еритроцити були отримані у відносно однорідної групи жінок (6 осіб): жінки були однакового віку (45-50 років) і на одній і тій же стадії онкологічного захворювання (III стадія).

Метод вивчення активності ферментів спектрофотометричний (Спекорд 200, СФ-6), метод визначення білка фотоелектроколориметричний, вивчення впливу солей молочної кислоти буде проводиться за допомогою модельних експериментів.

Модель: це клітини  крові (еритроцити), тканина пухлинних вузлів узята у хворих на РМЗ та віддалена суміжна не трансформована тканина молочної залози тих самих жінок. Еритроцити для дослідження двічі відмивали в 0,9% розчині NaCl, при 3000 об/хв. Використовували фосфатний буфер рН 7,4, до якого додавали відмиті еритроцити та різні концентрації лактата натрія.  Для еритроцитів кінцевою концентрацією лактату у пробі була концентрація 7,5мМ, 10мМ, 15мМ, 20мМ, 25мМ та 30мМ. Інкубація еритроцитів з лактатом була 60 хвилин. Після інкубації еритроцити гемолізували. Гемоліз еритроцитів проводили при додані дистильованої води. Еритроцити не мають ядра та мітохондрій і в цих клітинах відсутні ефекти пов'язані з експресією генів, тому можна думати о змінах каталітичної активності, а не о збільшені кількості ферментів. Після гемолізу визначали активність аденозиндезамінази. Вели спостереження за накопиченням продукту реакції який є інозином на длині хвилі 265 нм на спектрофотометрі в гемолізаті еритроцитів та гомогенаті тканин.

Тканини гомогенізували у скляному гомогенізаторі. Додавали різні кількості лактату до еритроцитів та гомогенату тканин. Стосовно тканин кінцева концентрація лактату в інкубаційному середовище дорівнювала 10мМ, 20мМ та 30мМ. Інкубацію з лактатом проводили протягом 60 хвилин.

Використовували тканини 20 хворих жінок на рак молочної залози які були взяті після радикальної мастектомії. Всі хворі були на одній і тій самій стадії захворювання, у віці від 23-73 років. Ці тканини гомогенізували у скляному гомогенізаторі. Для приготування гомогенату зразки тканин масою 5 г ретельно промивали охолодженим фізіологічним розчином, подрібнювали ножицями, гомогенізували за допомогою льоду у 0,25М розчині сахарози на 5 мМ трис-НCl-буфері (рН = 8,1) та 0,15М КCl. Отриманий гомогенат центрифугіровали протягом 60 хвилин при 3000 об / хв. До субстрату додавали розчин NH4SO2 до 40% насичення, після чого центріфугіровалі протягом 60 хв 3000 об / хв, до надосадової рідини додавали 5 мМ трис-HCl буферу (рН = 8,1), який містив 0,001 М меркаптоетанолу. Визначення АДА засноване на зміні оптичної щільності реакційної суміші при довжині хвилі 265 нм, що зумовленомо дезамінуванням аденозину до інозину.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою ліцензійнного пакету програм STATISTICA-6.0 (StatSоft, Inc). Цифрові дані у таблицях та у тексті представлені середніми значеннями позначаються "М" та їх стандартними відхиленнями "м". Відмінності між середніми показниками вважали значущими коли р <0,05.

 

 

 

 

 

2.2 Вплив лактату на активність АДА в еритроцитах здорових.

 

З метою вивчення впливу лактату на активність ферменту обміну пуринових нуклеотидів - АДА були проведені модельні експерименти в яких використовувалися різні концентрації лактату натрію. Для визначення впливу аніону молочної кислоти на активність АДА в еритроцитах здорових добровольців-чоловіків.

Ці дослідження з еритроцитами здорових людей демонструють, що при збільшенні концентрації лактату натрія у досліджуваній пробі активність АДА збільшується.

При різних концентраціях лактату  у пробі активність аденозиндезамінази суттєво відрізняється в залежності від різниці між контрольною пробою та дослідною пробою . І це показано у табл.2.1

Таблиця 2.1

Вплив різних концентрацій лактату на активність АДА в еритроцитах  здорових

Концентрація  лактату натрія в пробі, мМ	Відсоткове  збільшення активності АДА в порівняні с контролем
7,5	106,4%
10	127,8%
15	104,6%
20	263,1%
25	183,7%
30	166,7%