Кинетические кривые роста микроорганизмов в закрытых системах

 

Противопоказания: беременность, повышенная чувствительность, эпилепсия, заболевания  печени.

 

Препараты рекомбинантного гамма-интерферона.

 

Анаферон.

 

Рекомбинантный интерферон-гамма.

 

Форма выпуска : таблетки по 3 гр.

 

Обладает иммуномодулирующим и  противовирусным действием.

Показание к применению: профилактика и лечение  гриппа и ОРВИ.

Противопоказания: индивидуальная непереносимость.

287. Методы анализа, основанные на использовании моноклональных (в отдельных случаях поликлональных) антител. Иммуноферментный анализ (ИФА).

 

Иммуноферментный  анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

 

Сущность и классификация

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных  соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Возможна  классификация по типу иммунохимического  взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в  системе присутствуют только анализируемое  соединение и соответствующие ему  центры связывания (антиген и специфические  антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе  одновременно присутствует анализируемое  соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие  за ограниченное количество центров  специфического связывания, то метод  является конкурентным.

Примером  неконкурентного формата ИФА  является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

Прямой конкурентный формат ИФА  использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченыйантиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.

 К иммобилизованным антителам  добавляют раствор, содержащий  определяемое вещество и фиксированную  концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки  носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

 Преимуществом прямой схемы  является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать  анализ. К недостаткам схемы относятся  сложность методов синтеза ферментных  конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

В непрямом конкурентном формате ИФА  используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и  иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.

 Непрямая схема с использованием  меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

 Применение универсального  реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.

 

Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при  определении антител к различным  инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям.[1] Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.

 

Таким образом, за счёт несомненных  преимуществ иммуноферментного  анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации  учёта результатов, возможности  исследования иммуноглобулинов различных  классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Основные  типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов

В зависимости  от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

Рекомбинантные — в которых  используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

Пептидные — использующие химически  синтезированные фрагменты белков.

Общее направление  развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

 

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена.

 

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего  антигенного многообразия возбудителя  выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам).

 

Кроме того, большое значение имеет  качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение  рекомбинантной тест-системы практически  со 100%-ной специфичностью при высокой  чувствительности.

Антитела  моноклональные.

 

Гибридомы - это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности. При этом, естественно, все молекулы иммуноглобулинов, продуцируемые определенной гибридомой, идентичны: они относятся к одному классу и одному аллотипу, имеют одинаковые вариабельные области , структуру, идиотип , аффинность и специфичность к данному эпитопу .

 

Получение:

Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон).

Другой метод получения антител  основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки. Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител.

Иммунофлюоресцентный

 

Области применения моноклональных антител:

идентификация субпопуляций лимфоцитов человека

истощение клеточных популяций

выделение клеток

установление функций молекул  клеточной поверхности

определение группы крови

диагностика опухолей

локализация опухолей

иммунорадиометрический анализ

анализ сложных смесей антигенов

анализ эмбрионального развития

моноклональные мутантные антитела

квадромы

анализ иммунного ответа

искусственные ферменты.

 

Перспективы использования гибридомной техники поражают воображение. Особенно ценными станут гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела, которые можно будет применять для терапевтических целей.

 

Поликлональные и моноклональные антитела

 

 Сыворотку крови, содержащую  антитела к какому-либо антигену, называют антисывороткой. Антисыворотка, как правило, поликлональна, поскольку содержит антитела, продуцируемые разными клонами плазматических клеток. Антисыворотку обычно получают путем иммунизации организма каким-либо антигеном.

 

 Поликлональная антисыворотка может быть моноспецифической, то есть содержащей антитела к разным эпитопам одного и того же антигена. Например, выпускают поликлональные моноспецифические антисыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов М, G, А человека. Каждая такая антисыворотка содержит поликлональные антитела, направленные к различным эпитопам какой-либо цепи иммуноглобулинов.

 

Моноклональные антитела продуцируются одним клоном плазмоцитов. Разработан метод получения больших количеств моноклональных антител с помощью, так называемой гибридомной технологии, являющейся одной из составляющих клеточной инженерии.