Исследование некоторых патогенных свойств золотистого стафилококка

При наличии  лецитоветилазной активности у стафилококков на ЖСА вырастают колонии, окруженные радужным венчиком, который особенно хорошо виден при косом освещении. Из части выросших колоний стафилококка готовят мазки на стекле, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в мазке грамположительных кокков , оставшуюся часть колоний пересевают на скошенный МПА для накопления чистой культуры и помещают в термостат в прежнем режиме на 24 часа.

3 этап: видовая  идентификация стафилококков.

Проводится на основании комплекса биологических  свойств выделенной чистой культуры. Для дифференциации стафилококков  от стрептококков определяют каталазную активность. Для постановки этого теста изучаемую чистую культуру помещают с помощью стеклянной палочки в каплю 3-10 %  раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями, выделение пузырьков свидетельствует о присутствии стафилококков. Стрептококки каталазной активностью не обладают.

Пересев чистой культуры на плотные питательные среды ( в чашку Петри).

Чашку берут  в левую руку, большим пальцем  левой руки слегка приподнимают крышку, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели , вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли. С помощью метода посева штрихом материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки , избыток снимают, проколов агар. Оставшийся материал растирают параллельными штрихами по поверхности среды. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Микробиологическая  диагностика читинских  клинических штаммов  золотистого стафилококка  

1.Исследование  на носительство  стафилококка среди  студентов ЧГМА.

Материалом для  нашего исследования послужил забор  слизи из носовой полости. Забор проводили ватным тампоном, содержимое которого наносили на стерильное предметное стекло, затем проводили окраску по Граму и микроскопировали. В мазках обнаруживали грамположительные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, располагающихся поодиночке, парами, короткими цепочками или в виде гроздевидных скоплений, что и свидетельствовало о наличии стафилококков в  исследуемом материале.

2.Оценка  влияния лизоцима  на стафилококк  in vivo.

У себя и своих одногруппников брали мазки из носовой полости для выявления носителей золотистого стафилококка . Всего носителей оказалось 6 человек. Разбив перепелиное яйцо мы поместили белок в одноразовые стерильные пробирки и отдали их носителям золотистого стафилококка,дополнительно объяснив, что в течении 5 дней по 15 минут каждое утро и каждый вечер нужно производить аппликацию носовой полости ватными тампонами смоченными в белке перепелиных яиц . И спустя пять дней мы производили контрольный посев. 

3.Выращевание золотистого стафилококка.

 Мы  брали несколько клинических  штаммов золотистого стафилококка  и сравнивали их активность  по помутнению вокруг колоний.  Выделив несколько самых активных  штаммов, мы  пересевали их  на ЖСА. Для этого над спиртовкой  прокаливали петлю, остужали её, забирали материал из одной  чашки Петри и помещали в  другую, опять прокаливали петлю  и ставили чашку в термостат.

4.Оценка плазмокоагулазной активности.

Гепаринезированную  кровь разводят  стерильным  физиологическим раствором   в соотношении 1 : 3 или 1 :5  и разливают по  0,2—0,3  мл  в стерильные пробирки, которые перед стерилизацией должны быть тщательно вымыты, так как остатки химических веществ могут влиять на результат плазмокоагуляции.

    Испытуемые  агаровые культуры стафилококков вносят  петлей  в  плазму и

хорошо перемешивают. Бульонные культуры вносят пипеткой в объеме  0,1  мл  В каждом опыте необходимо ставить контроль с  культурами  заведомо  патогенных стафилококков, дающих коагулазную реакцию, и штаммами  коагулазоотрицательных микроорганизмов. Кроме того, часть пробирок с разлитой  плазмой следует оставлять не засеянной микробами и выдерживать в  термостате  на  протяжении всего срока опыта. В случае наступления коагуляции хотя бы в  одной  из  них весь опыт нужно переставить с новой порцией крови. Пробирки  с  исследуемыми

культурами выдерживают  в  термостате  при  37  °С  в течение суток.  Учет

результатов проводится обязательно дважды: через 2—3 ч  и  24 . Учитывают

свертывание  плазмы  и  образование  сгустков.  Обычно   культуры,  активно

продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2—3 ч. а если они обладают и выраженной фибринолитической  активностью,  то  первоначально образовавшиеся сгустки  могут  подвергнуться  расплавлению  к  концу  суток. Слабокоагулирующие штаммы  могут давать  положительную реакцию в  поздние сроки—к  концу  суток.  Опыты,  давшие  сомнительный  результат,  необходимо повторить. 

5.Оценка температурной резистентности плазмокоагулазы золотистого стафилококка.  

Выращенный стафилококк  забирали стерильной петлёй  и помещали в восемь стерильных пробирок  содержащих 5 мл физиологического раствора. Всё  тщательно перемешивали и нагревали  на водяной бане. По мере роста температуры  вынимали пробирки. Первую пробирку нагревали от 45⁰,вторую до 47⁰,третью до 49⁰ ,четвёртую до 51⁰, пятую до 53⁰, шестую до 57⁰ , седьмую до 60⁰ , контрольную пробирку мы не подвергали нагреву. Затем мы брали планшету для титрования и капали туда мерной пипеткой на 0,2 гепаринезированную плазму донора ,а другой мерной пипеткой на 0,1 капали стафилококк из пробирок. Планшету помещали в тёплое место и следили за какое время образуются фибриновые нити и какой стафилококк потеряет эту способность из – за нагрева. 

6. Оценка роста и лецитовителлазной активности золотистого стафилококка.

Для исследования роста лецитовителлазной активности мы использовали элективно-дифференциальную  среду  для стафилококков  —   желточно-солевой    агар   (ЖСА) . Элективность  этой  среды обеспечивается  высоким содержанием   хлористого натрия, а добавленный яичный  желток  позволяет  выявлять  лецитовителлазную активность,     которая   является   одним   из   показателей   патогенности стафилококков и в силу  этого  ЖСА  более  четко  дифференцирует  патогенных представителей, чем кровяной агар.

 Следует производить  массивный посев исследуемого  материала на  чашки  с ЖСА, а инкубацию вести в течение 2 суток при 35—37°  С.  Посторонняя  флора резко подавляется, стафилококки же на ЖСА вырастают  практически  в  чистой культуре. Непосредственно при просмотре  чашек  вокруг  колоний  отмечается образование радужных венчиков и мутной зоны —  лецитовителлазная   реакция.     Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды  без  радужного  ободка,  в этом случае проба  на  лецитовителлазу  считается отрицательной.  Если  же колонии, выросшие на ЖСА, не  дают  лецитовителлазной  реакции,  т.  е.  не окружены радужным венчиком, но  имеется  рост  стафилококков,  то  их  тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух  из  каждого  такого посева на чашки с простым питательным агаром  пятнами диаметром 5—10  мм. После суточного инкубирования при 37° С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей  на стекле в каплях человеческой плазмы, разведенной  1:4.  Образование  хлопьев  учитывают  в  течение  30с—1  мин.  При  наличии плазмоагглютинации такие штаммы  считают подозрительными  и отвивают  на скошенный агар для дальнейшего изучения в коагулазной  реакции. 

7.Оценка роста и лецитовителлазной активности золотистого стафилококка при нагреве. 

Выращенный  стафилококк забирали стерильной петлёй и помещали в стерильные пробирки содержащие 5 мл  физиологического раствора. Нагревали пробирки от 60⁰ до 100⁰С. На чашку Петри со средой ЖСА стерильной петлёй из пробирок наносили штрихи. Ставили в термостат. Оценивали,  при какой температуре золотистый стафилококк не растёт, и при какой температуре теряет лецитовителлазную активность.

8. Оценка влияния на рост золотистого стафилококка «лизоцима» перепелиных яиц.

Брали планшету в 12 лунок заливали 0,4 мл физиологического раствора затем добавляли в первую лунку мерной пипеткой на 0, 02 стафилококк и раститровывали его по оставшимся 11 лункам. Нитки смачивали в спирте, после просушивали их и помещали в лунки под номерами 1, 5, 9 и 12 с раститрованным стафилококком. В чашке Петри с ЖСА вырезали треугольник стерильным скальпелем, доставали пропитанные стафилококком нитки и накладывали их поперёк вырезанного треугольника и заливали треугольник белком перепелиных яиц. Ставили чашку в термостат спустя сутки оценивали рост стафилококка.

9. Гемолитическая активность

Для изучения токсигенности стафилококков удобно  пользоваться  методом,

предложенным  Илеком и Леви (1950), позволяющим определить типы гемолизинов. С этой целью готовятся  чашки  с  питательным  агаром,  содержащим  5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток,  после чего учитывают результаты.

       
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Результаты  исследования 

1.В результате  бактериоскопического исследования мы выявили носителей золотистого стафилококка среди студентов ЧГМА, при этом у некоторых лиц грамположительный кокк был выявлен внутри эпителиальной клетки слизистой оболочки носовой полости.

2. Обработка  носовой полости в течении 5 дней ( по 15 минут днём и вечером) никак не повлияла на количество стафилококка в носовой полости. По-нашему мнению, причиной этому явилось наличие наиболее агрессивных штаммов, часть которых была обнаружена даже внутриклеточно. 

3. Стафилококки,   дающие   положительную   коагулазную   пробу,    должны рассматриваться как потенциально  патогенные,  независимо  от  наличия или отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к виду St. Aureus.    Углубленное изучение стафилококков показало, что основной  признак патогенности — коагулазная  реакция может подвергаться    изменчивости  при воздействии различных факторов. Во внимание мы взяли влияние температурного фактора на плазмокоагулазу. Результат показал,  что плазмокоагулазная активность исчезает почти при температуре 55-60⁰.

При 60 ⁰свёртывание плазмы, вернее появление единичных фибриновых нитей происходит только через сутки.

4.Лецитовителлазная (фосфолипазная) активность исчезла при температуре 53+2⁰ С. Читинские клинические штаммы золотистого стафилококка выдерживают нагрев до 75⁰С . 

5. «Лизоцим» перепелиных яиц тормозит рост  золотистого стафилококка только в том случае, если использовалась низкая микробная нагрузка.

6.При исследовании  гемолитической активности мы  не обнаружили гемолиза. Объяснением  этого явилось то , что гемолитическая способность, определяемая на  чашках с кровяным  агаром,  зависит от  многих  факторов  —   вида   крови,   ее концентрации, наличия в ней антитоксинов, толщины слоя  среды,  содержания углекислого газа в атмосфере культивирования, густоты посева, присутствия и характера сопутствующей флоры и т. д.

    При   отборе  колоний  с  кровяного  агара   необходимо   отвивать   как

гемолитические,  так и не  дающие  гемолиза,  особенно  если  исследование

проводится на среде  с  человеческой    кровью,  а  отсутствие гемолиза на  таких  средах  не  позволяет  заключить  об  отсутствии  вообще гемолитической  активности.  Поэтому  использование  кровяного   агара   для первичного  посева  целесообразно только  при обследовании  объектов,   не содержащих посторонней микрофлоры. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выводы.

1.Нам удалось  выявить чистую культуру читинских  клинических штаммов золотистого  стафилококка.

2.Оценили температурную  резистентность стафилококка , которая составила 75⁰

3.Опредили температурную  резистентность плазмокоагулазы, составившую 60⁰ , а также температурную резистентность лецитиназы равную 53+2⁰.

4.Перепелиные яйца можно использовать для торможения размножения золотистого стафилококка, если отделить «лизоцим» от альбумина ,т.е. лишить стафилококка питательной среды. Действие «лизоцима» in vivo никак не повлияло на количество грамположительного кокка.

5. Гемолитическая  активность не была нами выявлена.