Исследование некоторых патогенных свойств золотистого стафилококка

Актуальность:  

Стафилококковая инфекция является одной из наиболее часто возникающих инфекций. Связано  это с чрезвычайной распространенностью  стафилококков в природе. Для  человека особую важность имеют несколько  видов стафилококка, в том числе  и золотистый стафилококк. Золотистый стафилококк является возбудителем таких болезней как фурункулы, ячмени, пиодермия (стафилодермия), ангина, нагноение ран, панариций (воспаление кожного валика вокруг ногтя), а также служит причиной пищевых отравлений и тяжелых инфекций, протекающих по типу заражения крови. Десятки заболеваний людей и зверей обязаны своим появлением стафилококку, при лечении стафилококка доктора испытывают серьезные затруднения, нет на земном шаре человека, у которого хотя бы раз в жизни не возникли осложнения со здоровьем, связанные именно со стафилококком.

Стафилококки - это целый класс микроорганизмов, на данный момент известно уже 37 видов, при этом 14 видов являются симбионтами человека. Большинство стафилококков совершенно безвредны: из упомянутых 14 видов, только 3 способны вызывать заболевания, но и этих трех более чем достаточно.

Коварность и  болезнетворность любой бактерии, а  стафилококк в данном аспекте  не исключение, обозначается присутствием так называемых "факторов патогенности" - т. е. опасен не микроб сам по себе, а совершенно определенные вещества (либо входящие в состав создаваемые бактерией в процессе жизнедеятельности).

Стафилококки  – распространенное семейство бактерий. Они присутствуют у большинства  людей и являются частью нормальной микрофлоры кожных покровов, слизистых  оболочек и нижнего отдела кишечника. Носительство стафилококка часто встречается  и у медицинского персонала. Заражение  стафилококком в больницах и  роддомах происходит воздушно-капельным  путем и через загрязненные руки медиков. Заразиться можно через  открытые раны, ожоги, глаза, кожу, кровь. Возможна передача инфекции с инструментами, катетерами, перевязочным материалом, предметами ухода, а также пищей. MRSA – это «модификация» золотистого  стафилококка (Staphylococcus aureus), устойчивая к одному или более антибиотикам. На сегодняшний день исследователи обнаружили 17 видов MRSA, отличающиеся разной степенью устойчивости к антибиотикам. Для лечения MRSA необходимо применение более высокой дозы препаратов, увеличение длительности лечения или использование альтернативного антибактериального средства, к которому данный вид MRSA все еще чувствителен.  
 
 

Цель: изучение некоторых факторов патогенности золотистого стафилококка, таких как: :плазмокоагулазная, лецитиназная , гемолитическая активность, а также воздействие лизоцима и температурного фактора на рост колоний стафилококка in vitro и   in vivo. 

Задачи:

1.Выделить  чистую культуру штаммов золотистого  стафилококка.

2.Оценить  температурную резистентность читинских клинических штаммов золотистого стафилококка.

3.Определить  температурную резистентность плазмокоагулазы, лецитиназы .

4.Исследовать  влияние «лизоцима» перепелиных  яиц in vitro и in vivo.

5.Выявить  гемолитическую активность золотистого  стафилококка. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение

Исторические  данные. Гнойно-воспалительные заболевания кожи, мягких тканей и внутренних органов известны с древнейших времен. В 1880 г. Л. Пастер впервые обнаружил возбудителей в гное из фурункула и назвал их «пиогенными вибрионами». В 1884 г. они были изучены и описаны Ф. Розенбахом под названием «стафилококки». Большая заслуга в изучении стафилококковых заболеваний принадлежит отечественным ученым: М. Г. Данилевичу, В. А. Цинзерлингу, В. А. Хрущовой, О. И. Базан, Г. Н. Вы-годчикову, Г. Н. Чистовичу, Г. А. Тимофеевой, А. К. Акатову, В. В. Смирновой, Г. А. Самсыгиной.

Стафилококк — это вид бактерий, относящихся к граммоположительным коккам. На сегодняшний день их насчитывается уже 37 разновидностей. Примерно 14 различных видов стафилококка постоянно находятся на коже и слизистых оболочках человека. Однако не все из них способны вызвать заболевания. Лишь некоторые из бактерий стафилококка опасны тем, что провоцируют самые различные симптомы.

Стафилококки  обычно встречаются в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь. Отдельные  кокки, приметно 1 мкм в диаметре, имеют тенденцию объединяться в  скопления, поскольку их деление  происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и дочерние клетки сохраняют  своеобразное пространственное групповое  взаиморасположение. При специальных  условиях они могут располагаться  поодиночке, попарно, или в виде коротких цепочек. Они неподвижны, не образуют спор и активно растут практически  на всех искусственных средах, обычно образуя непрозрачные, гладкие, блестящие  колонии. Поскольку стафилококки продуцируют  каталазу, перекись водорода, образующаяся как метаболит при аэробных условиях, для них не токсична, и, большей  частью, они лучше растут в присутствии  кислорода. Однако, они легко переносят отсутствие кислорода, а некоторые из них даже являются строгими анаэробами. Они лучше растут при температуре 25 - 35°С, но могут расти и при 8° и при температуре выше 48°С. При культивировании на кровяном агаре в аэробных условиях образуют пигменты - от золотистого до лимонно желтого и белого цвета. Золотистый пигмент дал название одному из видов стафилококка - Staphylococcus aureus. Однако, при этом, некоторые штаммы золотистого стафилококка могут продуцировать и белый пигмент. Стафилококки устойчивее других бактерий к действию жара, света, высушивания, экстремальных температур и химических агентов. Они выдерживают 60°С в течение часа, а отдельные штаммы даже 80°С в течение 30 минут, хотя большинство вегетативных форм бактерий погибают при воздействии 60°С в течение 30 минут. Благодаря своей устойчивости к высушиванию стафилококки могут переноситься с частицами пыли, могут недели и месяцы сохраняться в высохшем гное или мокроте. Другой особенностью стафилококков является их устойчивость в солевой среде (не погибают при концентрации NaCl до 15%). В связи с этим способны сохраняться в консервированных продуктах (пресервах). В продуктах питания, сохраняемых путем соления, стафилококки могут расти и продуцировать энтеротоксин. Эти микробы устойчивы к действию фенола и большинству других дезинфектантов, чувствительны к основным красителям. Имеют тенденцию к формированию резистентности к сульфаниламидам и антибиотикам. Около 80% штаммов Staphylococcus aureus резистентны к пенициллину. Род Staphylococcus представлен тремя видами:

1. Staphylococcus aureus;
2. Staphylococcus epidermidis;
3. Staphylococcus saprophyticus.

 

Виды различаются  преимущественно по биохимическим  свойствам и вырабатываемым ферментам. Staphylococcus aureus ферментирует манит в анаэробных условиях и продуцирует коагулазу, тогда как два других вида лишены этих свойств.

Стафилококк золотистый (S. аureus) — относится к трем наиболее опасным видам микроба Вид золотистого стафилококка включает не менее 6 биоваров (А, В, С, D, E, F). Возбудителем заболеваний человека является биовар А, остальные варианты патогенны для различных животных и птиц. Он является основным виновником гнойных процессов, а его колонии — под микроскопом отличаются золотистым оттенком. При попадании в кровь он вырабатывает коагулазу, образующую тромбы. Именно они защищают стафилококк золотистый от действия иммунитета и антибиотиков. Стафилококк золотистый легко и незаметно распространяется по всему организму. Потому он становится причиной внезапных заболеваний: поражения клапанов сердца, маститов, отитов, пневмоний. Яды стафилококка золотистого вызывают синдром токсического шока у женщин при менструации, сильные пищевые отравления при употреблении жирных продуктов, мяса и консервов.

Только  золотистый стафилококк обладает полным арсеналом повреждающих факторов. Только он способен упорно и изобретательно отбиваться от антибиотиков и антисептиков. Никаких поблажек, никаких скидок на пол и возраст — и новорожденные, и взрослые, и старики: все уязвимы, чувствительны, подвержены… Нет такого органа в организме человека, куда бы не смог проникнуть золотистый стафилококк и где бы он не смог вызвать воспалительный процесс. Возникновение не менее ста опаснейших человеческих болезней прямо связано с золотистым стафилококком и только с ним.

Уникальная  особенность именно стафилококка —  выживать в растворах натрия хлорида, т. е. поваренной соли. 3 чайных ложки соли на стакан воды — выдержит легко. Почему это так важно? Да потому, что только стафилококк может выжить в потовой железе . А еще микроб вырабатывает фермент липазу, которая разрушает жиры вообще и сальную пробку в устье волосяного мешочка в частности. Очевидное и печальное следствие: практически 100% кожных гнойников (ячменей, фурункулов, карбункулов и т. д.) — это золотистый стафилококк .

Учитывая современные  тенденции в классификации микроорганизмов  рода Staphylococcus, выделенные культуры исходя из их способности коагулировать плазму, мы подразделили на коагулазоположительные (КП) и коагулозоотрицательные (КО) стафилококки. Сочетание нескольких факторов патогенности в большей степени свойственно представителям S. aureus. Однако не все культуры, традиционно относящиеся к КП видам, в том числе и S. aureus, вызывают  плазмокоагуляцию.

В патогенезе стафилококковой  инфекции, наибольшее значение имеют плазмокоагулаза, ДНК-аза, гиалуронидаза, лецитиназа, фибринолизин, протеиназа.

-плазмокоагулаза обусловливает свертывание плазмы;

- гиалуронидаза способствует распространению стафилококков в тканях;

-лецитиназа разрушает лецитин, входящий в состав оболочек клеток;

-фибринолизин растворяет фибрин, отграничивающий местный воспалительный очаг, способствуя генерализации патологического процесса.

Патогенность  стафилококка в первую очередь обусловлена  способностью вырабатывать токсины:

- гемолизины — альфа (а), бета (р), гамма (у), дельта (5), эпсилон (е),

-лейкоцидин,

- эксфолиативные,

-энтеро-токсины (А, В, Cj, Сг, D, E, F),

- Токсин-1 (TSST-1).

Основным в  группе гемолизинов является а-гемолизин, продуцируемый золотистым стафилококком. Он вызывает повреждение тканей, дермонекротический, нейротоксический и кардиотоксический эффекты.

а-гемолизин оказывает цитотоксическое действие на клетки амниона и фибробласты человека, клетки почек обезьян, культуры тканей HeLa, тромбоциты, макрофаги.

р-гемолизин лизирует эритроциты человека, кролика, барана, собаки, птиц, оказывает литическое действие и на лейкоциты.

у-гемолизин обладает широким спектром цитотоксической активности, в низких дозах, подобно холерному энтеротоксину, вызывает увеличение уровня цАМФ и повышение секреции ионов Na⁺ и С1⁺ в просвет кишки.

Лейкоцидин оказывает губительное воздействие на фагоцитирующие клетки, главным образом, полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги, обладает выраженной антигенной активностью.

Эксфолиативные токсины вызывают у человека стафилококковый синдром «обожженной кожи».

Стафилококковые энтеротоксины термостабильные, устойчивые к протеолитическим энзимам, вызывают у детей пищевые отравления. Энтеротоксины обусловливуют развитие в кишечнике изменений, аналогичных псевдомембранозному энтероколиту, вызывают синдром токсического шока, влияют на иммунокомпетентные клетки и их предшественники.

Токсин-1 (TSST-1) обнаруживается только у некоторых штаммов золотистого  стафилококка и обусловливает развитие синдрома токсического шока.

Поверхностные структуры микробных клеток стафилококков  представляют сложную систему антигенов  с разнообразной биологической  активностью. Антигенными свойствами обладают: пептидогликан, тейхоевые кислоты, белок А,  хлопьеобразующий фактор, типоспецифические агглютиногены, полисахаридная капсула.

Пептидогликан обладает эндотоксиноподобным эффектом (пирогенность, воспроизведение феномена Швартцмана, активация комплемента и др.).

Тейхоевые кислоты вызывают активацию комплемента по классическому пути, реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Белок А присутствует в клеточной стенке S. aureus и способен к неспецифическому соединению с Fc-фрагментом IgG, обладает свойствами преципитиногена и агглютиногена.

Хлопьеобразующий фактор препятствует эффективному фагоцитозу.

Полисахаридная  капсула не является компонентом  клеточной стенки стафилококка, однако связана с ней структурно и  рассматривается как поверхностный  соматический антиген. Биологическая  активность капсульных полисахаридов  выражается, главным образом, в их антифагоцитарном действии.

Стафилококки  имеют ряд плазмид, которые обладают признаками устойчивости к антибиотикам, способностью к синтезу коагулазы, гемолитических токсинов, фибринолизина, пигментов. Плазмиды резистентности легко передаются от золотистого стафилококка к эпидермальному, от стафилококков — кишечной, сенной палочке и другим бактериям.

В течение инфекционного  процесса стафилококки могут изменять свои ферментативные, инвазивные и токсигенные свойства. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Материалы и методы исследования некоторых свойств золотистого стафилококка. 

Бактериологическое  исследование стафилококка проводится в три этапа.

В качестве среды  накопления используют бульон с 6,5%  NaCl, разлитый в пробирки по 5 мл, в который вносят по 0,5 мл смывной жидкости.

1 этап: первичный  посев материала.

Для выделения  чистой культуры производят на селективные  среды: ЖСА, МЖСА, КМПА. Среды с исследуемым  материалом помещают в термостат (температура 37⁰ ) на 18-24 часа. Для лучшего выявления пигмента чашки с ЖСА дополнительно выдерживают на свету при комнатной температуре еще 24 часа.

2 этап: изучение  культуральных свойств.