Генная инженерия

     Если  при рестрикции образуются фрагменты  без «липких» концов, то их «насильственно»  конвертируют в молекулы с «липкими»  концами, используя фермент трансферазу. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15--20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.

     5  ВВЕДЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК В КЛЕТКИ 
 

     После смыкания интересующего фрагмента  ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью ДНК-лигазы образованные реком-бинантные молекулы вводят в  клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и  увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых  вектором служит плазмида. С этой целью  бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами) для того, чтобы они стали  «компетентными» в восприятии рекомбинантной ДНК.

     Чтобы повысить частоту проникновения  ДНК в клетки, используют метод  электропорации, заключающийся в  кратком экспонировании клеток в  интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости  в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК- После  введения рекомбинантных молекул ДНК  в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками  для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает  на 106 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к  трансфекции клеток (бактерий или  дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию  осуществляют ДНК в присутствии  химических веществ, облегчающих прохождение  ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции  ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

     Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клониро-ванием, является поиск способа, позволяющего установить, действительно  ли клонируемый фрагмент включился  в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Однако при этом плазмидный (векторный) ген ампициллинрезис-тентности инактивируется, тогда как ген тетрациклинрезистентнос-ти на векторе остается интактным. Именно, ген тетрациклинрезис-тентности и используется для селекции клеток, трансформируемых рекомбинантными молекулами ДНК. Чтобы убедиться, что клетки выросших колоний на среде с тетрациклином действительно содержат рекомбинантные молекулы ДНК, их проверяют с помощью так называемого «спот-теста» на паре чашек с плотной средой, одна их которых содержит ам-пициллин, тогда как другая лишена этого антибиотика. Клонируемые ДНК содержатся лишь в трансформантах, резистентных к тетрациклину Что касается трансформантов, резистентных одновременно к ампициллину и тетрациклину, то они содержат плазмидные (векторные) молекулы, которые спонтанно приобрели кольцевую форму без включения в них чужеродной (клонируемой) ДНК. Другой способ обнаружения инсерции чужеродных (клонируемых) фрагментов в плазмидный вектор основан на использовании вектора, содержащего ген. Инсерция чужеродной ДНК в этот ген неизбежно инактивирует синтез р-галактозидаза, что может быть обнаружено посевом трансформированных клеток на среду, которая содержит субстраты р-галактозидазы. Эта среда позволяет селекцию окрашенных колоний клеток.

     Как уже отмечено, рестрикционные линейные фрагменты векторной ДНК способны к восстановлению кольцевой структуры  без включения в них клонируемых  сегментов. Чтобы уменьшить частоту  спонтанного образования таких  кольцевых молекул векторной  ДНК, рестрикты векторной ДНК  обрабатывают фосфатазой. В результате этого образование кольцевых  молекул ДНК становится невозможным, поскольку будут отсутствовать концы, необходимые для действия лигазы.

     Совокупность  колоций-трансформантов, выросших на селективной  среде, представляет собой совокупность клеток, содержащих клоны разных фрагментов (генов) клонируемой геномной или кДНК. Коллекции этих клонов формируют так называемые библиотеки ДНК, широко используемые в генно-инженерных работах.

     Заключительной  стадией клонирования генов является выделение и исследование клонированной  ДНК, включая секвенирование.

     Перспективные штаммы бактерий или соматических клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, которые контролируют синтез интересующих белков, имеющих коммерческую ценность, передают в промышонструирование рекомбинантных молекул ДНК

     Непосредственное  конструирование рекомбинантных молекул  ДНК следует после того, как  получены рестрикты исследуемой  ДНК и векторной ДНК. Оно заключается  в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой  ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

     Если  при рестрикции образуются фрагменты  без «липких» концов, то их «насильственно»  конвертируют в молекулы с «липкими»  концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3-концу ДНК. На одном фрагменте  может быть добавлен поли-А-хвост, на другом -- поли-Т-хвост. Для генерации  любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР  основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с  добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих  из 15--20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды  должны быть комплементарны последовательностям  в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой»  для синтеза ДНК in vitro, они позволяют  ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое  количество копий изучаемого фрагмента  ДНК. 
 

     СПИСОК  ЛИТЕРАТУРЫ 

1. Биология. В 2 кн. (Учебник) Под ред. В.Н. Ярыгина 2003, 5-е изд.,

2. Микробиология. (Учебник) Гусев М.В., Минеева Л.А.  2003.

3. Биология  с основами экологии. (Учебник) Пехов А.П. 2000.

4.  История  Земли и жизни на ней.  Еськов  К.Ю. 1999.

5. Концепции  современного естествознания.   Алексеев С.И.; 2003.

6. Концепции современного естествознания.   Горбачев В.В. 2005.

7. Концепции современного естествознания.  Гофман В.Р. 2001.

8. Биология с основами экологии. Пехов А.П.2000.

9. Генетика, эволюция, значение методологии в естествознании Тимофеев-Ресовский Н.В. 2009.

10. Генетика  популяций  Хедрик Ф. 2003.