Генная инженерия

     ОГЛАВЛЕНИЕ 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     ВВЕДЕНИЕ 

     Генную  инженерию составляет совокупность различных экспериментальных приемов (методик), обеспечивающих конструкцию (реконструкцию) и клонирование молекул  ДНК (генов) с заданными целями.

     Методы  генной инженерии используют в определенной последовательности, причем различают  несколько стадий в выполнении типичного  генно-инженерного эксперимента, направленного  на клонирование какого-либо гена, а  именно:

     1. Выделение ДНК из клеток интересующего  организма (исходного) и выделение  ДНК-вектора.

     2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного  организма на фрагменты, содержащие  интересующие гены, с помощью  одного из ферментов-рестриктаз  и выделение этих генов из  образованной рестрикционной смеси.  Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее  из кольцевой структуры в линейную.

     3. Смыкание интересующего сегмента  ДНК (гена) с ДНК вектора с  целью получения гибридных молекул  ДНК.

     4. Введение гибридных молекул ДНК  путем трансформации в какой-либо  другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки.

     5. Высев бактерий, в которые вводили  гибридные молекулы ДНК, на  питательные среды, позволяющие  рост только клеток, содержащих  гибридные молекулы ДНК.

     6. Идентификация колоний, состоящих  из бактерий, содержащих гибридные  молекулы ДНК.

     7. Выделение клонированной ДНК  (клонированных генов) и ее  характеристика, включая секвенирование  азотистых оснований в клонированном  фрагменте ДНК.

     ДНК (исходная и векторная), ферменты, клетки, в которых клонируют ДНК - все это называют «инструментами» генной инженерии.

1  ВЫДЕЛЕНИЕ  ДНК 
 

Рассмотрим  методику выделения ДНК на примере  ДНК плазмид. ДНК из плазмидосодержащих бактериальных клеток выделяют с  помощью традиционной техники, заключающейся  в получении клеточных экстрактов в присутствии детергентов и  последующем удалении из экстрактов белков фенольной экстракцией Полная очистка плазмидной ДНК от белков, РНК и других соединений проводится в несколько стадий. После того как клетки разрушены, например, с  помощью лизоцима (растворены их стенки), к экстракту добавляют детергент, чтобы растворить мембраны и инактивировать некоторые белки. Большинство хромосомной  ДНК удаляют из получаемых препаратов обычным центрифугированием.

     Часто для полной очистки используют хроматографию. Если требуется очень тщательная очистка, используют высокоскоростное центрифугирование в градиенте  плотности CsCI с использованием этидия бромида. Оставшаяся хромосомная ДНК  будет фрагментирована в линейную, тогда как плазмидная ДНК останется  ковалентно закрытой. Поскольку этидий бромид менее плотен, чем ДНК, то при ультрацентрифугировании в  центрифужной пробирке будет «выкручиваться»  два кольца -- плазмидная ДНК и  хромосомная ДНК Плазмидную ДНК  отбирают для дальнейшей работы, хромосомную  ДНК выбрасывают. 
 
 
 
 
 
 
 

     2  ФЕРМЕНТЫ-РЕСТРИКТАЗЫ ДНК 
 

     В ходе эволюции бактерии развили способность  синтезировать так называемые рестрицирующие ферменты (эндонуклеазы), которые стали  частью клеточной (бактериальной) системы  рестрикции-модификации. У бактерий системы рестрикции-модификации  являются внутриклеточной иммунной системой защиты от чужеродной ДНК. В  отличие от высших организмов, у  которых распознание и разрушение вирусов, бактерий и других патогенов  происходит внеклеточно, у бактерий защита от чужеродной ДНК (ДНК растений и животных, в организме которых  они обитают) происходит внутриклеточно, т. е. тогда, когда чужеродная ДНК  проникает в цитоплазму бактерий. С целью защиты бактерии в ходе эволюции развили также способность  «метить» собственную ДНК метилирующими  основаниями на определенных последовательностях. По этой причине чужеродная ДНК из-за отсутствия в ней метальных групп  на тех же последовательностях плавится (разрезается) на фрагменты разными  бактериальными рестриктазами, а затем  деградируется бактериальными экзонуклеазами до нуклео-тидов. Можно сказать, что  таким образом бактерии защищают себя от ДНК растений и животных, в организме которых они обитают  временно (как патогены) или постоянно (как сапрофиты).

     Рестриктазы впервые были выделены в 1968 г- Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I. Затем  у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого  класса стали использовать в генной инженерии. Тогда же были открыты  ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии.

     Действие  системы рестрикции-модификации  «рационализуется» так называемыми  палиндромными (распознающими последовательностями) азотистых оснований, которые являются сайтами рестрикции ДНК. Палиндромные последовательности - это последовательности оснований, которые одинаково читаются вперед и назад, как, например, последовательность букв радар. Поскольку цепи ДНК обладают антипараллельным направлением, то считают, что последовательность является палиндромной, если она идентична, когда читается в направлении от 5- к 3-концу на верхней и 3- к концу на нижней цепи

     Рестриктазы - это абсолютно необходимый инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.

     Замечательной особенностью рестриктаа является то, что они продуцируют разрезы  молекул на несколько фрагментов (рестрик-тов) ДНК уступами, в результате чего в образующихся концах одна цепь длиннее другой, образуя своеобразный хвост. Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов т. к. они способны к самокомплементарности. Рассмотрим результаты рестрикции на примере одной  из наиболее известных рестриктаз из системы рестрикция-модификация. Вместо того, чтобы плавить ДНК в центре палиндромной последовательности узнавания, этот фермент плавит ДНК за пределами центра и продуцирует 4 самокомплементарных («липких») конца, состоящих из разного количества нуклео-тидов, а именно:

     Эти «липкие» концы в генно-инженерных опытах полезны по той причине, что  они могут быть воссоединены комплементарно при низких температурах, что позволяет  эффективное смыкание ДНК-фрагментов.

     Сайты распознания и сайты плавления  в случае других рестриктаз имеют  другое содержание, а именно:

     Вслед за рестрикцией ДНК из рестрикционной смеси выделяют рестрикционные ДНК-фрагменты (ДНК-рестрикты), которые необходимы затем для объединения с вектором. Для выделения ДНК-рестриктов прибегают  к электрофорезу, поскольку с  помощью этого метода рестрикцированную  ДНК очень легко фракционировать  благодаря размерам фрагментов-рестриктов и благодаря константным отношениям электрический заряд-масса. Фрагменты  в электрическом поле мигрируют  в ходе электрофореза при частоте, зависимой от их размеров (массы). Чем  больше (длиннее) фрагмент, тем медленнее  он мигрирует в электрическом  поле. Материалом, в котором проводят электрофорез, являются незаряжающиеся агаро-за и полиакриламид.

     После электрофореза фрагменты из агарозы  выделяют с помощью разных методов. На основании результатов сравнения  размеров рестриктов одной и той  же ДНК, полученных с помощью разных рестриктаз, строят рестрикционные карты, на которых показывают сайты рестрикции каждой из использованных рестриктаз В практическом плане рестрикционные карты позволяют определять не только размеры рестриктов, но и выяснять расположение в молекулах ДНК  локусов тех или иных генов.

     Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии  обычно используют комплементарную  ДНК (кДНК), которую получают при  использовании в качестве матрицы  мРНК, на которой обратная транскриптаза  синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем  эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что  кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции. 
 
 

     3  ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЕКТОРЫ 
 

     Сегмент ДНК (ген), который предназначен для  молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную  клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение  клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми  генетическими векторами. Последние  должны обладать, как минимум, двумя  свойствами. Во-первых, векторы должны быть способны к репликации в клетках, причем в нескольких копиях. Во-вторых, они должны обеспечивать возможность  селекции клеток, содержащих вектор, т. е. обладать маркером, на который можно  вести контрселекцию клеток, содержащих вектор вместе с клонируемым геном (рекомбинантные молекулы ДНК). Таким  требованиям отвечают плазмиды и  фаги. Плазмиды являются хорошими векторами  по той причине, что они являются репликонами и могут содержать  гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести  селекцию бактерий на устойчивость к  этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК.

     Поскольку природные плазмидные векторы неизвестны, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно. Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых  с помощью рестриктаз удаляли  излишние последовательности ДНК, в  том числе те, на которых располагались  множественные сайты рестрикции. Это удаление определялось тем, что  плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной  рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома. Фаговые  векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами. Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате ин-фицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага лямбда.

     Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой  ДНК.

     Если  клонирование генов проводят, используя  клетки млекопитающих или растений, то требования к векторам те же, что  и в случае клонирования в бактериальных  клетках. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     4  КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК 
 

     Непосредственное  конструирование рекомбинантных молекул  ДНК следует после того, как  получены рестрикты исследуемой  ДНК и векторной ДНК. Оно заключается  в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой  ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

     Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой  ДНК с ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу Лигирование будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3-гидроксил  и 5-фосфатной группами и если эти  группы расположены соответствующим  образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате са-мокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие ре-стриктазы, продуцируют  «липкие» концы, состоящие из 4-х  оснований. Процесс лигирования  «липких» концов, состоящих из четырех  оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С).