Жидкостная хроматография. Определение фенолов

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Санкт-Петербургский государственный технологический университет

растительных полимеров

Заочный факультет

 

 

 

 

 

 

 

 

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

 

 

РЕФЕРАТ.

 

 

 

ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛОВ

 

 

 

 

 

Выполнила:

студентка IV курса Раннель Е.М.

 

 

 

 

 

 

 

Проверила:

Галина Федоровна Пругло

 

 

 

 

 

 

 

Дата регистрации работы факультетом:

 

 

 

 

Санкт-Петербург

2013

Основные понятия и принцип разделения.

Жидкостная хроматография (ЖХ) - способ (метод) хроматографического разделения в котором подвижной фазой является жидкость и разделяемые вещества находятся в постоянном равновесии между подвижной и неподвижной фазой. По типу неподвижной фазы различают: жидкостно-жидкостную, жидкостную-твердофазную и жидкостно-гелевую хроматографии (см. рис.1).

Подвижная   фаза   в   жидкостной   хроматографии   выполняет   двоякую  
функцию: 1) обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке ; 2)  регулирует константы  равновесия,  а,  следовательно,  и  удерживание  в  результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ. В ЖХ природа подвижной фазы имеет существенно большее значение. В результате комбинации ограниченного числа   сорбентов   и   неограниченного   числа,   различных   по   составу, подвижных   фаз   возможно   решение  чрезвычайно   большого   числа встречающихся на практике задач. Метод ЖХ применим для разделения значительно более широкого круга веществ, чем газовая хроматография, поскольку  большая  часть  веществ  не  обладает  летучестью,  а  многие вещества  неустойчивы  при  высоких  температурах.  В  ЖХ  разделение обычно происходит при комнатной температуре.

ЖХ  подразделяется  на  варианты  в  соответствии  с  характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий:

- в ситовой  хроматографии разделение компонентов  осуществляется за   счет   разницы   в   растворимости   молекул   при   их   прохождении (фильтрации) через слой сорбента;

-   в   адсорбционной   хроматографии -   за   счет разницы   в адсорбируемости  молекул,  проходящих  через  слой  частиц  сорбента, покрытых    неподвижной    фазой    в    виде    тонкого    слоя    или поверхностнопривитых радикальных групп;

- в ионообменной и ионной  хроматографии - за счет разницы  в способности к обмену ионами с ионообменниками;

Сфер применения ЖХ очень много. Практически незаменима ЖХ при определении и фракционировании высокомолекулярных лабильных соединений биологического происхождения: нуклеиновых кислот и белков. Поначалу основным недостатком метода, по сравнению с газовой хроматографией, была его низкая разрешающая способность, обусловленная несколькими причинами: высокой вязкостью подвижных фаз, и, следовательно, низкой скоростью диффузии; неоднородностью подвижных фаз; ограничения в длине колонки и т.д. Но значительный прогресс в производстве высокоточных приборов (в первую очередь насосов), сорбентов и вычислительной техники привел к появлению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимого по числу теоретических тарелок с газовой хроматографией (N ~ 100000). Основным отличием ВЭЖХ от классической колоночной ЖХ является использование мелкодисперсных (<10 mkm) сорбентов на основе жестких матриц (зачастую из силикагеля) и высоких скоростей потока.

Для   анализа   объектов   окружающей   среды   наиболее   широко используют ВЭЖХ в адсорбционном и ионообменном вариантах.

 

Система для проведения разделения методом ВЭЖХ.

Система для проведения разделения методом ВЭЖХ состоит из нескольких   блоков:   насоса,   дозатора,   колонки,   детектора   и регистрирующего устройства.

Рассмотрим основные типы насосов, используемых в ВЭЖХ.

Шприцевые насосы. Вращение прецизионного синхронного двигателя преобразуется   в   перемещение   поршня   в   цилиндре.   При движении  поршня подвижная  фаза  либо  поступает  в  цилиндр,  либо выдавливается из него. Преимущество данного типа насоса - практически полное  отсутствие  пульсаций  потока  подвижной  фазы,  недостаток - невозможность создания градиента с помощью одного насоса.

Пневмоусилительные насосы. Обеспечивают постоянное давление на  входе  в  колонку.  Преимущества - отсутствие  пульсаций  потока, высокая   надежность;   недостаток  -  невысокая воспроизводимость объемной подачи подвижной фазы.

Плунжерные   возвратно-поступательные   насосы.   С   помощью электромеханического устройства приводится в возвратно-поступательное движение плунжер, перемещающийся в рабочей головке, в результате чего насос либо набирает подвижную фазу, либо подает ее с заданной скоростью.  Преимущество - постоянная  объемная  подача  подвижной фазы,  недостаток  -  довольно  большие  пульсации потока,  которые являются   основной   причиной   повышенного   шума   и   снижения чувствительности  детектора.

Для   ввода   пробы   в   жидкостной   хроматографии   используют следующие типы дозаторов:

- дозирующая петля 

- дозаторы с мембраной (без остановки потока и с  остановкой потока).

Основные виды детекторов и их характеристики приведены в табл.1.  Наиболее  распространенным детектором в адсорбционной ВЭЖХ является спектрофотометрический. В процессе элюирования веществ в специально   сконструированной   микрокювете   измеряется   оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны, соответствующей максимуму   поглощения   определяемых   веществ.   Такие   детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой или видимой области спектра, причем первый вариант используется чаще. Это связано с тем, что большинство  химических  соединений  имеют  достаточно  интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200-360 нм. Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность.

Чувствительность УФ-детектора может достигать 0,001 ед. оптической  
плотности на шкалу при 1% шума. При такой высокой чувствительности  
может быть зафиксировано до нескольких  нг даже слабо поглощающих  
УФ   веществ.   Широкая   область   линейности   детектора   позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме.    Возможности    спектрофотометрического    детектора существенно расширились после появления его современного аналога - детектора на диодной матрице (ДДМ), работающего как в УФ-, так и видимой области. В таком детекторе «матрица» фотодиодов (их более 200)  
постоянно  регистрирует  поглощение  электромагнитного  излучения  в режиме    сканирования.    Это    позволяет    снимать    при    высокой чувствительности   неискаженные   спектры   быстро   проходящих   через ячейку детектора компонентов. По сравнению с детектированием на одной длине волны, сравнение спектров, полученных в процессе элюирования пика, позволяет идентифицировать разделяемые компоненты с гораздо большей степенью достоверности.

Принцип  действия  флуориметрического  детектора  основан  на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра, длины волн флуоресцентного  излучения превышают     длины     волн поглощенного света.

Флуориметрические  детекторы обладают очень  высокой чувствительностью   и   селективностью.   Наиболее   важная   область   их  применение  детектировании ароматических полициклических углеводородов.

Амперометрический   детектор   применяют   для   определения органических соединений, которые могут быть окислены на поверхности твердого  электрода.  Аналитическим  сигналом  является  величина  тока окисления. В детекторе имеется по крайне мере два электрода - рабочий и электрод   сравнения (хлоридсеребрянный   или   стальной),   иногда устанавливают вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния   омического   падения   напряжения   в   растворах   низкой  
проводимости. Успех   определения определяет   выбор   материала   и потенциала рабочего   электрода.   В   амперометрическом   детекторе используют   электроды   из   углеродных   материалов,   наиболее   часто стеклоуглеродный,  и  металлические:  платиновый,  золотой,  медный, никелевый. Потенциал рабочего электрода устанавливают в интервале 0 - +1,3 В. Можно проводить измерения либо при постоянном потенциале,  
либо  импульсном  режиме,  когда  задается  трехступенчатая  развертка потенциала,   которая   обеспечивает   на   разных   стадиях -  окисление вещества, очистку электрода и его регенерацию. Использование этого детектора   особенно   важно   при   определении   фенолов,   фенольных соединений, гидразинов, биогенных аминов и некоторых аминокислот.  
 Кондуктометрический  детектор  используют  для  определения неорганических анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

 Исключительно информативным является масс-спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Основная проблема, затрудняющая использование этого детектора, проблема ввода потока элюента в масс-спектрометр. Развитие микроколоночной хроматографии позволяет разработать системы прямого ввода потока элюента в ионный источник масс-спектрометра. Используют масс-спектрометры высокого разрешения и   достаточного   быстродействия   с   химической   ионизацией   при  атмосферном    давлении    или ионизацией с применением электрораспыления.    Последние    модели    масс-спектрометров    для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до 4000  а.е.м.  Масс-спектрометрический  детектор  предъявляет  жесткие требования к чистоте растворителей, является дорогостоящим и сложным в обращении.

Табл.1 Детекторы   для   высокоэффективной   жидкостной хроматографии, используемые в анализе объектов окружающей среды

 

Вид детектора	Измеряемый параметр	Минимальное определяемое количество, г	Селективность
Спектрофотометрический	Оптическая плотность	10-10	Высокая
Флуометрический	Интенсивность флуоресценции	10-11	Очень высокая
Кондуктометрический	Электропроводность	10-9	Низкая
Амперометрический	Величину тока	10-11 – 10-9	Очень высокая
Масс-спектрометрический	Величину ионного тока	10-12 – 10-10	Очень высокая

Определение фенолов.

Высокоэффективная жидкостная   хроматография   активно используется   для   определения различных экотоксикантов в водах и почвах. Наиболее значимые задачи, решаемые  ВЭЖХ  в  анализе  вод  и  почвы  -  определение  фенольных соединений, ПАУ и пестицидов. Так как ПДК этих экотоксикантов в водах и   почвах   очень   низки,   их   определение   обычно   проводят   после предварительного концентрирования или выделения. Для этого можно использовать жидкостную экстракцию, но более удобным и эффективным методом является сорбция или твердофазная экстракция.

Весьма распространенными    экотоксикантами    являются    фенол    и    его хлорпроизводные и нитропроизводные, гваякол, крезолы. Эти соединения образуются   в   процессе   производственной   деятельности   человека,   в частности,  в целлюлозно-бумажном    производстве.

Возникает необходимость  их  определения  в  различных  типах  вод:  природных, водопроводной, производственных и сточных. Состав вод весьма сложен и может   включать   большое   число   фенольных   соединений,   которые образуются как на стадии загрязнения, так и в процессе очистки вод. Наиболее  вероятными  компонентами  сточных  вод  являются  фенол, гваякол, о-, м- и п-крезолы, моно-, ди-,три- и пентахлорфенолы, моно- и динитрофенолы. Для разделения и одновременного определения летучих и малолетучих    фенолов    весьма    удачным    является    использование  
высокоэффективной жидкостной хроматографии на гидрофобизированном  
силикагеле.   Эффективность   и   селективность   разделения   фенолов определяется составом подвижной фазы. Наиболее часто для разделения фенолов  в  ВЭЖХ  используют  смеси  ацетонитрила  или  метанола  с буферными   растворами (ацетатными   или   фосфатными),   успешное разделение фенолов различного состава может быть достигнуто, если в качестве   водного   компонента   подвижной   фазы   используется   вода, подкисленная уксусной, хлоруксусной или фосфорной кислотой. Время  
удерживания фенолов определяется их гидрофобностью и увеличивается с  
ее ростом. Для наиболее значимых фенолов, загрязнителей окружающей  
среды, удерживание растет в ряду: катехол < фенол < 4-нитрофенол <  
гваякол < п-крезол < 2,4-нитрофенол < 2-нитрофенол < 2-хлорфенол < 4- 
хлорфенол < 3-хлорфенол < 2,4-диметилфенол < 4-хлор-3-метилфенол <  
2,4-дихлорфенол < 2,4,6- трихлорфенол < пентахлорфенол и зависит от  
состава подвижной фазы. Чем больше в ней содержание ацетонитрила или  
метанола, тем меньше удерживание. Для разделения столь сложной смеси  
фенольных   соединений   не   удается   подобрать   подвижной   фазы  
определенного  состава.  Необходимо  либо  использование  градиентного  
элюирования, либо разные фенолы делят с использованием различных  
подвижных фаз.

Низкие    ПДК    фенольных    соединений    в    водах    требуют чувствительных    методов    детектирования    или    предварительного концентрирования.   Достаточно   успешным   является   детектирование фенолов с использование ДДМ, предел обнаружения фенола при длине волны 260   нм   в   этом   случае   достигает 1   мг/л.   Еще   большей чувствительностью  и  селективностью  к  фенолу  и  его  производным  
обладает  амперометрический  детектор.  Его  использование  позволяет  
определять фенолы на уровне ПДК даже в природных водах. В природных  
водах ПДК для фенола составляет 0,001 мг/л, п-хлорфенола - 0,002 мг/л,  
2,4-дихлорфенола - 0,004 мг/мл, 2,4,6 - трихлорфенола - 0,006 мг/л и  
пентахлорфенола -0,01   мг/л.   Амперометрическое   детектирование основано на окислении фенолов на поверхности твердого электрода, в качестве   которого   обычно   используют   стеклоуглеродный   электрод. Установлено, что максимальный сигнал регистрируется при потенциале стеклоуглеродного электрода - +1300 мВ относительно стального или +1100  мВ  относительно  хлоридсеребрянного   электродов   сравнения.  
Важным является использование в качестве компонента подвижной фазы  
фосфорной  кислоты,  в  этом  случае  минимальны  флуктуации  базовой  
линии сигнала амперометрического детектора, что позволяет уменьшить величину    минимальной    определяемой    концентрации,    которая соответствует сигналу, равному удвоенной “ширине” базовой линии. В табл. 2. приведены примеры определения фенола в водах в различных условиях, на рис. 2 показана хроматограмма смеси, а на рис. 3 – 5 определение фенолов в водопроводной и сточной воде.