Химико-токсикологический анализ

 Спиртовые вытяжки соединяют вместе, а биологический  материал промывают спиртом. Спирт присоединяют к слитым ранее порциям вытяжек. Извлечения отфильтровывают и сгущают до густоты сиропа под уменьшенным давлением или в фарфоровой чашке на водяной бане, имеющей температуру воды не выше 40° (во избежание разрушения таких веществ, как атропин, кокаин, и некоторых других соединений, имеющих характер сложных эфиров). Сиропообразную жидкость обрабатывают 96°, а еще лучше абсолютным спиртом, приливая его по каплям и перемешивая жидкость стеклянной палочкой. Спирт добавляют до тех пор, пока не прекратится осаждение белков.

 Осторожное  добавление спирта вызывает осаждение  белковых, веществ в виде мелких хлопьев, не захватывающих раствора, что может иметь место при добавлении большого количества спирта сразу, когда осадок выделяется в виде больших сгустков.

 Жидкость  отстаивают, фильтруют, фильтр промывают  спиртом и фильтрат упаривают до густоты сиропа при описанных выше условиях. В сиропообразном остатке снова осаждают белки, жидкость отстаивают и фильтруют. Операцию осаждения белков повторяют до тех пор, пока спирт перестанет что-либо осаждать. Тогда вытяжку упаривают до густоты сиропа и обрабатывают 20—25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильтровывают и тщательно  промывают небольшим количеством воды.

 Из  водного раствора производят повторные  извлечения (3—4 раза) небольшими порциями (по 10—15 мл) хлороформа сначала из кислой, а затем из щелочной (рН 10) среды. Подщелачивание производят 25% раствором аммиака.

 Удобство  применения хлороформа в качестве растворителя заключается в том, что он достаточно хорошо растворяет большинство токсикологически важных органических веществ из группы изолируемых подкисленным спиртом и легко отделяется от водного раствора.

 Извлечение  как из кислой, так и из щелочной жидкости должно производиться осторожно, лишь легким взбалтыванием или многократным перевертыванием делительной воронки, но отнюдь не энергичными встряхиваниями. Последние могут вызвать образование трудноразделимой эмульсии. Образовавшуюся эмульсию можно попытаться разрушить, добавив 0,5—1 мл спирта и поставив объект исследования в теплое место. Расслоение достигается при насыщении жидкости сульфатом аммония. Лучшим способом является центрифугирование.

 Экстрагированием  хлороформом сначала из кислого, а затем из щелочного раствора преследуется цель разделения веществ, изолируемых подкисленным спиртом, на две большие подгруппы: 1) подгруппа веществ, экстрагируемых хлороформом из кислого раствора; 2) подгруппа веществ, экстрагируемых хлороформом из щелочного раствора.

 Экстрагирование хлороформом из кислого водного  раствора, кроме того, ставит своей задачей очистку жидкости от жира, красящих, дубильных и других веществ, мешающих дальнейшему качественному обнаружению алкалоидов и других токсикологически важных веществ основного характера.

 Из  числа веществ, представляющих токсикологический  интерес, хлороформ экстрагирует из кислого раствора: 1) кислоты и их производные; 2) многоатомные фенолы; 3) некоторые вещества нейтрального характера (полинитросоединения), производные анилина и парааминофенола; 4) слабые основания.

 Все хлороформные извлечения из кислого  раствора сливают вместе, фильтруют  через возможно маленький фильтр и отдельные порции исследуют на наличие производных барбитуровой кислоты и таких слабых оснований, как стрихнин, бруцин, кофеин и др.

 При наличии наводящих указаний (характерная  окраска хлороформного извлечения или остатка по удалении растворителя, например в присутствии пикриновой кислоты, кристаллическое строение при наличии полинитропроизводных, фенацетина и т. п.), так же как и при специальных запросах, круг исследований в той или иной степени расширяется или суживается.

 Практически в большинстве случаев бывает достаточно 3— 4-кратного экстрагирования. Хлороформные вытяжки из щелочного раствора также сливают вместе, промывают небольшим количеством воды, фильтруют через возможно маленький фильтр и хлороформ выпаривают при комнатной температуре в небольшой фарфоровой или стеклянной чашке. Остатки по удалении хлороформа исследуют на наличие алкалоидов и синтетических лекарственных веществ.

 Достоинства и недостатки метода изолирования подкисленным спиртом. Удобство применения этилового спирта для изолирования разнообразных органических веществ из объектов биологического происхождения заключается в его способности хорошо растворять многие органические вещества, а также свертывать, переводить в нерастворимое состояние белки — главную составную часть большинства объектов химико-токсикологического исследования (внутренние органы трупов, пищевые продукты животного происхождения и т. п.). При этом неизбежны потери искомых веществ, так как свернувшийся белок удерживает ту или иную часть их.

 Метод изолирования подкисленным спиртом  обладает рядом недостатков, к числу  которых относятся следующие:

 а) длительность настаивания объектов со спиртом, а также упаривания спиртовых вытяжек и удаления осажденных белков; в общей сложности обработка занимает 8—10 рабочих дней и больше (в случае упаривания спиртовых вытяжек на теплой водяной бане в открытых фарфоровых чашках);

 б) большое количество операций, связанных с очисткой спиртовой вытяжки от белков и продуктов белкового распада;

 в) возможность потери малых количеств алкалоидов и других веществ основного характера как вследствие сорбции их белками и фильтровальной бумагой (особенно при многократном фильтровании), так и в результате продолжительного нагревания кислого раствора;

 г) относительная дороговизна метода, так как на каждое исследование, например, внутренних органов трупа расходуется до 500 мл 96° этилового спирта. Все это приводит к тому, что классический метод Стаса—Отто как общий метод теряет свое значение и постепенно заменяется более быстрыми, эффективными и более экономичными методами, хотя он еще и сохраняет свою роль при изолировании некоторых веществ, плохо растворимых в воде, а также при исследовании биологических объектов в сильно гнилостном виде. 

2.4.2.2. ИЗОЛИРОВАНИЕ ПОДКИСЛЕННОЙ ВОДОЙ

 Метод изолирования подкисленной водой, предложенный Драгендорфом. Одним из описанных в литературе методов изолировании, главным образом алкалоидов, является метод Драгендорфа. Идея изолирования подкисленной водой высказывалась и до него рядом авторов, например Грэмом.

  По  методу Драгендорфа алкалоиды и  некоторые вещества неалкалоидного характера 2—3 раза извлекали при  температуре 40—50" водой, содержащей серную кислоту. Водные вытяжки упаривали  до сиропообразной консистенции, настаивали с 3—4-кратным объемом 96° спирта в течение 24 часов при температуре 30° и фильтровали. Фильтр с целью очистки обрабатывали петролейным эфиром, а затем последовательно экстрагировали бензином, хлороформом и снова петролейным эфиром. После извлечений из кислого раствора водную жидкость подщелачивали раствором аммиака и снова последовательно экстрагировали бензином и амиловым спиртом. Метод имел ограниченное применение, так как он обладал рядом недостатков, главным из которых являлись упаривание сернокислой вытяжки на водяной бане до сиропообразной консистенции и применение нескольких органических растворителей. Эти операции могли привести к значительным потерям ряда алкалоидов.

  Современная модификация метода извлечения подкисленной водой. В 1942 г. М. Д. Швайкова и А. В. Степанов для изолирования алкалоидов из объектов растительного происхождения предложили так называемый скоростной метод извлечения алкалоидов. В 1947 г. этот метод был применен А. А. Васильевой с целью изолирования алкалоидов из свежих внутренних органов трупа, а затем вошел в практику лабораторий.

  В 1956—1961 гг. проф. В. Ф. Крамаренко и его  сотрудники своими исследованиями показали необходимость учета рН среды  как в процессе изолирования алкалоидов из биологического материала, так и при экстрагировании их органическими растворителями из водных вытяжек (стр. 126). При учете этих данных исследование объектов растительного происхождения (мука, хлеб, крупа и т. д.) на наличие в них алкалоидов производится следующим образом: 5 г исследуемого объекта тщательно смешивают с 60 мл дистиллированной воды1, подкисленной насыщенным водным раствором винной (или щавелевой) кислоты до рН 2,0—2,5 (по универсальному индикатору), и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Периодически смесь взбалтывают. Водный слой сливают декантацией и подвергают центрифугированию 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Прозрачную жидкость переносят в делительную воронку и трижды новыми порциями (по 15—20 мл) осторожно, чтобы избежать образования эмульсии, экстрагируют хлороформом. Для разделения эмульсия (в случае ее образования) пользуются центрифугированием. Хлороформную вытяжку исследуют на группу веществ, экстрагируемых из кислого раствора, а также и некоторые алкалоиды и вещества, обладающие слабо основными свойствами (кофеин, стрихнин, бруцин).

  Водный  остаток подщелачивают раствором аммиака до рН 10 по универсальному индикатору и вновь 3—4 раза, соблюдая осторожность, экстрагируют небольшими порциями (по 15— 20 мл) хлороформа. Хлороформные извлечения, слитые вместе, по удалении хлороформа исследуют на наличие алкалоидов и других веществ основного характера.

  При исследовании на наличие алкалоидов соли, сахара и т. п. задача значительно  упрощается. Такие продукты растворяют в воде, подкисляют винной (щавелевой) кислотой до кислой реакции (рН 2—2,5) и повторно экстрагируют хлороформом из кислого раствора, а затем из раствора подщелоченного аммиаком до рН 10. Хлороформные вытяжки исследуют на наличие веществ, экстрагируемых хлороформом из кислого и щелочного растворов.

  При исследовании внутренних органов трупов (печень, желудок и т. п.) на наличие алкалоидов и других органических веществ поступают следующим образом: 100 г тщательно измельченного материала заливают 200 мл дистиллированной воды (соотношение объекта и воды 1:2), подкисленной до рН 2,0—2,5 насыщенным водным раствором винной или щавелевой кислоты, и оставляют на 2 часа при периодическом взбалтывании. Водное извлечение сливают с твердых частиц объекта, а последние еще раз настаивают, примерно час с водой, подкисленной винной или щавелевой кислотой до рН 2,5. Водную вытяжку процеживают через двойной слой марли. Объединенные извлечения центрифугируют. Прозрачную жидкость повторно экстрагируют хлороформом из кислого раствора (3—4 раза по 15—20 мл хлороформа), а затем из щелочного (3—4 раза). Подщелачивание до рН 10 производят 25% раствором аммиака, проверяя реакцию среды по универсальному индикатору.

  Соединенные вместе хлороформные вытяжки из кислого  раствора исследуют на вещества, изолируемые из кислых растворов, а хлороформные вытяжки из щелочного раствора — на алкалоиды и синтетические вещества основного характера.

  Достоинства и недостатки метода изолирования подкисленной водой. Метод изолирования алкалоидов и других органических веществ, имеющих токсикологическое значение, подкисленной водой обладает рядом преимуществ перед методом извлечения подкисленным спиртом. Наиболее важные из них следующие.

1.Ускорение  времени производства анализа  в 3—4 раза.

    2. Более высокая чувствительность  по отношению к ряду органических веществ: стрихнину, бруцину, кониину, колхицину, дикаину, ареколину и другим соединениям. Повышение чувствительности в основном связано с меньшим количеством операций, возможно, и с отсутствием нагревания.

    3. Метод не требует затраты чистого  этилового спирта. Недостаток метода заключается в трудности использования его для исследования на органические вещества, трудно растворимые в воде, а иногда также при исследовании сильно загнившего трупного материала.

 Кроме описанных методов изолирования алкалоидов, при химико-токсикологических исследованиях иногда для отдельных алкалоидов (ареколин, никотин, кониин) рекомендуется дистилляция с водяным паром с последующим экстрагированием алкалоида из дистиллята соответствующим органическим растворителем.

 Все описанные методы изолирования алкалоидов не гарантируют, однако, получения настолько чистого вещества, чтобы оно могло быть обнаружено и определено в дальнейшем обычными аналитическими реакциями и методами. Как правило, алкалоид или другое вещество основного характера, представляющее токсикологический интерес, изолируется из объектов исследования вместе с жирами, жирными кислотами, белками и продуктами их распада (смолы, красящие вещества и т. п.), маскирующими это вещество и мешающими его обнаружению и определению. Особое значение при этом приобретает очистка изолированных из биологического материала (трупный материал) алкалоидов. 

2.4.2.3. ИЗОЛИРОВАНИЕ ПОДЩЕЛОЧЕННОЙ ВОДОЙ

  При специальных заданиях произвести исследования объекта на наличие некоторых  веществ кислотного характера [салициловая или бензойная кислота, фенолы, нитрофенолы и др.] целесообразно изолирование этих веществ производить подщелоченной, например карбонатом натрия, водой.