84-85
Биомолекулы.
Пептиды и белки
Методы выделения и анализа
белков
Препараты высокоочищенных белков
находят разнообразное применение
в научных исследованиях, медицине
и биотехнологии. Так как многие
белки, и в особенности глобулярные,
высоколабильны (см. с. 80), выделение проводят с помощью предельно
мягких методов и при пониженной температуре
(0-5°С). К таким методам относитсяионообменная хроматография,
которая обсуждалась на с. 68. Другие методы выделения белков представлены
в этом разделе.
A. Высаливание
Растворимость
белков сильно зависит от концентрации
солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще
всего растворяются плохо, однако их растворимость
возрастает по мере увеличения ионной
силы. При этом все большее количество
гидратированных неорганических ионов
(светло-синие кружочки) связывается с
поверхностью белка и тем самым уменьшается
степень его агрегации (засаливание). При высокой
ионной силе молекулы белков лишаются
гидратирующих оболочек, что приводит
к агрегации и выпадению белка в осадок
(высаливание). Используя
различие в растворимости, можно с помощью
обычных солей, например (NН4)2SО4,
разделить (фракционировать) смесь белков.
Б. Диализ
Для
отделения низкомолекулярных примесей
или замены состава среды используют
диализ. Метод основан на том, что
молекулы белка из-за своих размеров
не могут проходить через полупроницаемые мембраны,
в то время как низкомолекулярные вещества
равномерно распределяются между объемом,
ограниченным мембраной, и окружающим
раствором. После многократной замены
внешнего раствора состав среды в диализном
мешочке (концентрация солей, величина
pH и др.) будет тот же, что и в окружающем
растворе.
B. Гель-фильтрация
Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация)
позволяет разделять белки по величине
и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках,
заполненных сферическими частицами набухшего
геля (размером 10-500 мкм) из полимерных
материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря
внутренним каналам, которые характеризуются
определенным средним диаметром. Смесь
белков (1б) вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы,
не способные проникать в гранулы геля
(помечены красным цветом), будут перемещаться
с высокой скоростью. Средние (зеленого
цвета) и небольшие белки (синего цвета)
будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля (1в). На выходе колонки элюат собирают в
виде отдельных фракций (2). Объем выхода того или иного белка зависит
в основном от его молекулярной массы
(3).
Г. Электрофорез в полиакриламидном
геле в присутствии додецилсульфата
натрия
В
настоящее время электрофорез в
полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии
додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез
(SDS-PAGE)] является общепринятым методом
определения гомогенности белковых препаратов.
Метод основан на свойстве заряженных
частиц (молекул) перемещаться под действием
электрического поля (см. с. 270). Обычно скорость миграции зависит от
трех параметров анализируемых белков:
величины молекул, формы молекул и суммарного
заряда. Поэтому предварительно белки
денатурируют с тем, чтобы скорость миграции
зависела только от молекулярной массы.
Для этого анализируемую смесь обрабатывают
додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C12H25OSO3Na),
который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами
(см. с. 34). Под действием ДСН олигомерные белки
диссоциируют на субъединицы и денатурируют.
Развернутые полипептидные цепи связывают
ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают
отрицательный заряд. Для полной денатурации
в среду добавляют тиолы, которые расщепляют
дисульфидные мостики (1).
Электрофорез
проводят в тонком слое полиакриламида
(2). После завершения электрофореза, зоны
белков выявляют c помощью красителя, В
качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов:
клеточного экстракта, содержащего сотни
белков (а); выделенного из экстракта гомогенного
белка (б); контрольной смеси белков с известными
молекулярными массами (в).
PAAG электрофорез
белков
Выбор % разрешающего
геля
Подготовка форезного
аппарата
Форез
Растворы
TGB
Разрешающий гель
Концентрирующий гель
30% AA
2x SDS- gel loading buffer
4x SDS- gel loading buffer with b-MeEtOH
Комментарии
Общие
По пунктам
Дополнения от людей
знающих
Дополнить |
|
Выбор % разрешающего
геля
Размер белка, kDa |
%AA |
36-205 |
5% |
24-205 |
7.5% |
14-205 |
10% |
14-66 |
12.5% |
10-45 |
15% |
|
Подготовка форезного
аппарата
- вымыть камеры детергентом, хорошо сполоснуть;
- мыть стекла детергентом (если очень грязные или из сомнительного источника - хромпиком); если хочется, чтобы гель легко снимался со стекол - силиконизировать (достаточно 1 раз на ~10 прогонов);
-
оценить объем геля:
гель: |
камера: |
мини |
миди |
концентр. |
~2ml |
~4ml |
разреш. |
~10ml |
~15ml |
|
- приготовить нижний/разрешающий гель (без TEMED);
-
дегазировать ~10', во время дегазации заняться форезным прибором:
* собрать форезный
прибор, отметить фломастером уровень
концентрирующего геля (длина зубчиков
гребенки + 1сm);
* ~5-10ml расплавленной 1.5% агарозы (в GTB-буфере)
налить на ровную горизонтальную поверхность.
Сразу же установить прибор со стеклами
(агароза поднимется между стеклами на
~2-10mm).
* "пролить" агарозой внешние края
спейсеров;
- залить разрешающий гель до отметки;
- наслоить сверху бутанол (~3-10mm);
- во время полимеризации дегазировать концентрирующий гель;
- после завершения полимеризации отсосать бутанол, 2-3 раза сполоснуть получившийся карман дистиллированной водой, отсосать остатки вытянутым типом;
- вставить (не полностью) гребенку между стеклами;
- залить концентрирующий гель, вставить полностью гребёнку;
- после полимеризации установить верхнюю камеру в нижнюю, залить буфер, вытащить гребенку;
- немедленно промыть лунки шприцом, поправить изогнувшиеся перегородки между карманами (либо плоским типом, либо иглой шприца);
Форез
- материал + буфер для нанесения, смешать, перед форезом прокипятить 5';
- перед нанесением промыть лунки шприцом;
- гнать при напряжении (для мини- и миди-камеры) ~10V/cm в концентрирующем геле, ~180V в разрешающем.
MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 41035
Растворы
TGB
Tris-Glycine buffer 5x, pH8.3, (хранить
основной сток при+4oС, рабочий сток
- приNT).
|
|
1x |
5x |
Сток |
1L |
1.5L |
|
Tris-base |
25mM |
125mM |
121.1g/M |
15.1g |
22.71g |
|
Glycine |
250mM |
1.25M |
75.05g/M |
94g |
141g |
|
SDS |
0.1% |
0.5% |
10% |
50ml |
75ml |
|
H2O |
|
|
mQ |
|
|
|
|
Разрешающий гель
(готовить непосредственно перед
применением)
10ml
|
5% |
6% |
7.5% |
10% |
12.5% |
15% |
AA, 30% |
1.666ml
|
2.0ml
|
2.5ml
|
3.33ml
|
4.16ml
|
5.0ml
|
H2O, mQ |
4.384ml
|
4.05ml
|
3.55ml
|
2.72ml
|
1.89ml
|
1.05ml
|
|
| |
Конц. |
Сток |
10ml
|
Tris-Cl pH 8.8 |
375mM |
1M |
3.75ml
|
SDS |
0.1% |
10% |
0.1ml
|
PSA |
0.1% |
10% |
0.1ml
|
TEMED |
0.08% |
100% |
8µl
|
|
Концентрирующий гель
(готовить непосредственно
перед применением):
|
|
Конц. |
Сток |
1ml |
2ml |
3ml |
4ml |
5ml |
|
H2O |
|
mQ |
0.68ml |
1.4ml |
2.1ml |
2.7ml |
3.4ml |
|
AA |
5% |
30% |
0.17ml |
0.33ml |
0.5ml |
0.67ml |
0.83ml |
|
TrisxCl pH6.8 |
0.13M |
1M |
0.13ml |
0.25ml |
0.38ml |
0.5ml |
0.63ml |
|
SDS |
0.1% |
10% |
10µl |
20µl |
30µl |
40µl |
50µl |
|
PSA |
0.1% |
10% |
10µl |
20µl |
30µl |
40µl |
50µl |
|
TEMED |
1µl/ml |
|
1µl |
2µl |
3µ1 |
4µl |
5µl |
|
|
30% AA
(стоковый раствор:
АА:BIS=29:1(хранить при+4oС, можно несколько
месяцев).
|
|
Конц. |
Сток |
100ml |
150ml |
200ml |
|
AA |
29% (w/v) |
тв. |
29g |
43.5g |
58.0g |
|
BIS |
1% (w/v) |
тв. |
1g |
1.5g |
2.0g |
|
H2O |
|
mQ |
|
|
|
|
|
2x SDS- gel loading buffer
(готовить без
DTT, хранить при NT; DTT добавлять
в аликвоту, которую хранить при +4oС
и использовать в течение месяца):
|
|
Конц. |
Сток |
10ml |
|
Tris-HCl (pH 6.8) |
50mM |
1M |
0.5ml |
|
Dithiothreitol |
100mM |
1M |
1.0ml |
|
SDS |
2% |
10% |
2.0ml |
|
Bromphenol blue* |
0.1% |
~100х |
0.1ml |
|
Glycerol |
10% |
100% |
1.0ml
1.25g |
|
H2O |
|
mQ |
5.4ml |
|
|
4x SDS- gel loading buffer with b-MeEtOH
Нельзя использовать
при серебряном окрашивании.
(Готовить без b-MeEtOH, хранить при NT; b-MeEtOHд
обавлять в аликвоту, которую хранить
при +4oС и использовать в течение
месяца)
|
|
Конц. |
Сток |
10ml |
|
Tris-HCl (pH 6.8) |
200mM |
1M |
2.0ml |
|
b-MeEtOH |
400mM |
14.5M |
280 µl |
|
SDS |
4% |
10% |
4.0ml |
|
Bromphenol blue* |
~0.01% |
~100х |
0.1ml |
|
Glycerol |
40% |
100% |
4.0ml
5.0g |
|
|
- мы добавляем совсем немного бромфенолового синего. Он нужен лишь для того, чтобы: (i) видеть образец в лунке, (ii) видеть положение фронта фореза. Количества, которые обычно приводятся в методиках дают слишком жирную полосу, которая даже мешает окрашиванию.
|
Смотри
также:
/ссылки на сетевые
ресурсы/
>> полная картинка и описание
>>
-- как прислать био-картинку -- |
|
|
|
Комментарии
Общие
- Разрешающий и концентрирующий гели имеют различные буфера, поэтому залитый гель нехорошо долго хранить. Если требуется гель очень высокого качества, то можно оставить ON на +4oС, не вынимая гребёнку и замотав верх и низ SaranWrap, чтобы не подсыхал. Если качество требуется умеренное (рутинный анализ), гель на +4oС можно хранить ~месяц.
- Бромфеноловый синий идёт с фронтом фореза. Ниже него белков нет.
- Опасно наносить на форез белок в высокой концентрации соли: 1) K+ (и некоторые другие катионы) способны выпадать в осадок с белком и SDS, 2) высокая соль не позволяет белкам войти в гель. Однако, часто концентрирующий гель способен обеспечить хорошую картинку даже если вначале в ячейке выпал осадок.
- В случае бактериальной культуры средней плотности на одну лунку PAAG 0.75х2.5mm2 нужно брать материал из ~15 µl бактериальной культуры.
- Дополнение от Маши: Чтобы ускорить процесс полимеризации, можно пластины с залитым гелем поставить в термостат с 37-60OC по Цельсию (или направить на них струю горячего воздуха от обогревателя). Это можно сделать после 10-15' после начала полимеризации. Реакция полимеризации идёт по свободно-радикальному механизму, поэтому она при повышении температуры ускоряется (несмотря на то, что экзотермическая).
По пунктам
п. 0.
- Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.
п.4.
- Дополнение:
Удобно приготовить раствор ПААГ (все, кроме персульфата аммония и ТЕМЕD) и отливать для заливки по мере надобности. Хранится такой сток два-три месяца совершенно спокойно.
п.5.
- Кислород - ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить раза в полтора количество PSA и TEMED).
п.6.
- Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.
п. 9.
- Можно промакнуть сложенной фильтровалкой.
п. 10.
- Вставлять гребенку после заливки геля - ненужная суета во время полимеризации, кроме того она выдавит в камеру значительный объём геля.
Дополнения от людей знающих
- Житков М.Ю., ЦНИИС, Москва.
- Очень удобны градиенты концентрации акриламида - их можно делать квазиступенчатыми. Для этого готовим 2 раствора - с наибольшей и наименьшей концентрацией, затем делаем 5-7 смешаных растворов и заливаем в камеру. Не надо тщательно насливать, растворы должны частично смешиваться! После полной заливки хорошо слегка помешать проволочкой, но не переусердствовать. Остаточная ступенчатость не влияет на качество разделения. Если она все же велика (вы очень тщательно наслаивали растворы), то обычно на геле видны "ступеньки". Такой гель можно выбросить.
- Я предпочитаю фотополимеризацию с рибофлавином для всех акриламидных гелей. Удобство - готовые смеси можно какое-то время и подержать (в темноте) и для ВСЕХ разгонок используется один раствор инициатора.
Дополнения, комментарии,
вопросы |