Экология продуктов питания

Грибы, продуцирующие токсины, могут  заражать растущие культуры вследствие их повреждения насекомыми, могут  вырабатывать токсины как до сбора  урожая, так и в периоды уборки и хранения.

Химическая структура афлатоксинов выяснена и имеются аналитические  методы их идентификации и определения  в пищевых продуктах и тканях организма (мкг/кг и ниже).

Афлотоксины B₁, B₂, G₁, G₂ обнаружены в продуктах растительного происхождения. Наиболее часто афлотоксинами загрязнены кукуруза, различные виды орехов (фисташки, фундук, арахис, грецкие орехи), пшеница, бобы какао, соя, сушеный инжир, чай. В организме животных афлатоксины могут метаболически разрушаться. Так, например, если в корме коров содержится афлотоксин В₁, то в молоке обнаруживается афлотоксин М₁, причем, концентрация его в 300 раз ниже, чем концентрация В₁ в корме. (Афлотоксином М₁ загрязняются преимущественно продукты животного происхождения.) В большинстве случаев в продуктах питания обнаруживается наиболее токсичный из основных афлотоксинов – афлотоксин В₁. Афлотоксины В₂, G₁ и G₂ менее токсичны, встречаются реже и в меньших концентрациях.

В настоящее время основным токсином, нормируемым в пищевых продуктах, является афлотоксин В₁. Его ПДК в Германии составляет 2 мкг/кг, 5 мкг во Франции и 1 мкг в Швеции. В России и РБ норма составляет 5 мкг/кг В₁ и 0,5 мкг/кг М₁ в молочных продуктах (при недопустимом содержании в них афлотоксина В₁.

Афлатоксины поражают в основном печень. Они являются канцерогенами и вызывают опухоли почек и печени. В₁ - типичный печоночный канцероген. (Интересно, что у крыс, добавление в пищу витамина В₁₂ приводит к увеличению частоты опухоли печени.) Афлотоксины также способны вызывать врожденные уродства и другие виды отдаленных последствий.

Афлатоксины относят обычно к соединениям  группы бискумариновых метаболитов, обозначаемых B₁, B₂, G₁, G_2.  Мало разрушаются при тепловой обработке. Соединения встречаются в естественных условиях в растительных продуктах. Идентификация этих четырех веществ основана на их характерной флуоресценции (группа В -голубая флуоресценция (blue), G - зеленая (green). Подстрочные индексы связаны с хроматографической подвижностью соединения.

 Афлотоксины М₁ и М₂ - содержатся в молоке коров (milk), в корме которых были афлотоксины В₁, В₂. Коровы экскретируют с молоком до 3% полученного с кормом афлотоксина В₁ в фороме высокотоксического метаболита – афлотоксина М₁.

Афлотоксины интенсивно флуоресцируют  под действием длинноволнового УФ излучения, что позволяет определять их в низких концентрациях (М₁ в молоке 0,02 мкг/л). Афлотоксины растворимы в умеренно полярных растворителях: CHCl₃, CH₃OH, ДМСО. В воде растворимость порядка 10-20 мг/л. (В₁  l_ех =265 360 нм, l_ем=425 нм.)

В виде чистых веществ афлотоксины чрезвычайно термостабильны при нагревании на воздухе, но относительно легко разрушаются под воздействием света, особенно УФ-лучей.

Анализ  афлотоксинов.

Афлотоксины встречаются в продуктах  различной природы (орехи, зерновые, какао, чай, мясо). Каждый из продуктов имеет свои особенности по составу, поэтому для определения афлотоксинов используется в каждом случае своя пробоподготовка.

Отбор проб представляет собой достаточно трудную задачу из-за неравномерного распространения в загрязненных продуктах.

Методы анализа. Для обнаружения афлотоксинов разрабатываются различные химические и биологические методы. Биологические методы, однако, длительные и характеризуются низким пределом обнаружения. Химические - не всегда специфичны, но более точны и экспрессны.  Обычно присутствие токсинов подтверждается образованием их производных, а токсичность определяется биопробой.

Биологичесие методы. 1)  Используют однодневных утят. Измеряют степень изменения желчных протоков при кормлении их продуктами, содержащими афлотоксины.2) Биопроба на куриных эмбрионах. Вводят афлотоксины и регистрируют смертность.

Химические методы.  Основные этапы:

• экстракция (метанол или хлороформ),
• удаление липидов,
• очистка.
• разделение
• количественное определение.

В зависимости от продукта методы могут быть упрощены. Химические методы разработаны для арахиса.

Пример: афлотоксины экстрагируют хлороформом, образец очищают на колонке, заполненной силикагелем, с использованием сульфата натрия. Обнаружение и количественнаяя оценка обеспечиваются методом 2-мерной ТСХ и денситометрической регистрации по флуоресценции или ВЭЖХ. Афлотоксины в растворе разрушаются под действием света, поэтому весь анализ проводят в темноте.

Определение афлотоксинов методом  ТСХ. Метод основан на экстракции афлотоксинов из исследуемой пробы водно-ацетоновой смесью или хлороформом, очистке экстракта колоночной хроматографией, концентрировании и двумерном хроматографировании в тонком слое силикагеля с флуоресцентным проявлением пятен при облучении УФ-светом. предел обнаружения афлотоксинов В, G – 2-5х10^-3 мг/кг, М₁ – 5х10^-4 мг/кг. Такая методика используется в настоящее время в РБ для контроля за содержанием афлотоксинов. Методика трудоемкая и недостаточно точная. Сегодня определение афлотоксинов проводят сочетая жидкость-жидкостнуюэкстракцию с распределительной хроматографией. Проба экстрагируется водой, вода - хлороформом, липиды и афлотоксины переносятся на колонку с силикагелем, где липиды избирательно элюируются гексаном, а пигменты и другие мешающие вещества вымываются абсолютным диэтиловым эфиром. На конечном этапе афлотоксины элюируются из колонки 3% расвором метанола в хлороформе. Этот метод называется методд СВ (Contamination Branch). Метод трудоемок и его упрощают. Используют жидкость-жидкостное распределение, а не колонку с силикагелем, и центрифугирование вместо фильтрации. Этом модифицированный метод называется методом на “высококачественные продукты” (BF, Best Food) 

Проба экстрагируется и обезжиривается двухфазной водной метанол-гексановой системой, после чего афлотоксины отделяются от водной фазы в хлороформ, а липиды и пигменты остаются в гексане и водном метаноле.

Афлотоксины концентрируют выпариванием хлороформа и отделяют методом ТСХ. Определяют по интенсивности флуоресценции. Количественное определение и идентификация возможны, если есть чистые стандарты.

Воспроизводимость метода BF снижается  при низких концентрациях.

Метод ТСХ дает хорошие результаты только при использовании флюоресцентного  денситометра, потому что он количественно оценивает содержание веществ на пластинке. При использовании УФ облучения пластинок и тестов с различными реактивами нельзя гарантировать высокую точность определения, так как многие вещества дают свечение в этой области. Эта методика может служить качественной оценкой присутствия афлотоксинов. Недостатками ее являются большие объемы растворителей, длительная процедура подготовки, многоэтапность, что может привести к потерям афлотоксинов.

Развитие методов хроматографии  привело к созданию ВЭЖХ, которая  практически полностью вытеснила тонкослойную. В ВЭЖХ для определения афлотоксинов используют несколько типов детекторов: диодно-матричный и флюоресцентный. При использованиии диодно-матричного детектора можно с высокой точностью проводить определение афлотоксина В₁, так как идентификация осуществляется по времени удерживания и по спектру вещества. Но для определения афлотоксинов с этим детектором необходима тщательная очистка пробы от пигментов и жироподобных веществ, поглощающих УФ в области 365 нм. Провести качественную очистку реальных проб без потерь самого афлотоксина – очень сложная задача. Афлотоксины в растворах крайне чувствительны к свету. Обычный анализ должен выполняться в темной комнате. При длительной пробоподготовке отмечаются дополнительные потери. Поэтому для количественного определения чаще используют флюоресцентный детектор. К преимуществам флюоресцентного можно отнести избирательность, высокую чувствительность. Определение афлотоксина В₁ проводится только по времени удерживания, многие примеси на этом детекторе не дают сигнала. По величине отклика на афлотоксин В₁ диодно-матричный детекор превосходит флюоресцентный. В отношении афлотоксинов  М₁ , G₁ , B₂ флюоресцентный детектор превосходит диодную матрицу.

В литературе описан ряд методик  определения афлотоксинов, отличающихся в плане экстракции и очистки афлотоксинов, а именно применяемых для этих целей растворителей. (Любая методика включает следующие стадии:

• измельчение пробы и экстракция афлотоксина;
• очистка экстракта и приотовление концентрированной пробы;
• количественное определение афлотоксина.)

Считают, что для наиболее надежного  определения афлотоксина В₁ в зерне, шпротах, жмыхах, комбикормах, подготовку пробы следует проводить следующим образом:

-.   экстракция пробы ацетоном,

-    фильтрация экстракта  и упаривание досуха на роторном испарителе,

• растворение остатка в метаноле и разбавление водой,
• 3-4-х кратное обезжиривание гексаном,
• экстракция афлотоксина из водно-метанольной смеси хлороформом,
• упаривание хлороформа на роторном испарителе или в токе инертного газа до объема 0,5-1 мл,
• очистка экстракта от пигментов на колонке с силикагелем.

При анализе проб риса и пшеничной  муки не проводят очистку экстракта  на колонке, т.к. эти продукты содержат мало пигментов. При анализе продуктов  с высоким содержанием жира (арахис, горчица и др.) увеличивают объемы применяемых для экстракции растворителей.

Описанная методика позволяет выполнять  определение в течение 2-2,5 часов  и определять следовые количества афлотоксина  В₁.

Эффективно использование метода ВЭЖХ (повышается чувствительность и точность).

Охратоксины вырабатываются некоторыми видами грибов Aspergillus и Penicillium. Эти грибы встречаются повсеместно. Aspergillus вырабатывает охратоксины при повышенной температуре и влажности, а Penicillium уже при 5⁰С.

Охратоксин А обнаружен в  кукурузе, ячмене, пшенице, овсе; может  содержатся в тканях убитых животных. Если охратоксин содержится в корме  животных, то его обнаруживают и  в тканях.Охратоксин В встречается  редко.

Охратоксины поражают почки.

Охратоксины представляют собой стрктурно-родственные  соединения типа:

Методы анализа  пищевых продуктов. Охратоксин А имеет голубую флуоресценцию. Содержится в окисленных продуктах и легко растворяется во многих органических растворителях, что используется для экстракции. Наиболее часто используется следующий метод: экстракция хлороформом и водным раствором фосфорной кислоты с последующей очисткой на колонке и количественное определение с использованием метода ТСХ.Разработан также метод ВЭЖХ. Кроме того, разработан ряд биопроб на креветках, бактериях, но результаты слабые.

Подготовка  образца перед ВЭЖХ: Измельченный образец обрабатывают смесью 2М соляной кислоты и 0,4 М раствора хлорида магния. После гомогенизации экстрагируют толуолом в течение 60 минут. Смесь центрифугируют. Центрифугат пропускают через колонку с силикагелем. Промывается смесью толуола с ацетоном (ПФ). Охратоксин А элюируется смесью толуола с уксусной кислотой (9:1) и высушивается при 40°С. Остаток растворяют и фильтруют. Анализ проводят с использованием ВЭЖХ.

Зеараленон   - лактон фенол резорциновой кислоты, характеризуется сине-зеленой флуоресценцией (lисп ⁼ 360 нм). Метаболит, продуцируемый различными видами Fusarium.. В естественных условиях зеараленон обнаружен в пшенице, ячмене, овсе и других зерновых продуктах. Особенно часто и в высоких концентрациях зеараленон загрязняет кукурузу, пораженную гнилью початков.  Зеараленон  нарушает у человека и животных функции воспроизводства. Потребление кормов с высоким содержание зеараленона может приводить к накоплению в тканях сельскохозяйственных животных и к экскретированию с молоком как зеараленона, так и его метаболитов, отрицательное действие которых на здоровье человека выше, чем у исходного микотоксина. В этой связи содержание зеараленона в зерновых на уровне, превышающем 1000 мк/кг, следует рассматривать как потенциально опасное для здоровья населения.

Определяют  методом ТСХ (измерение  флуоресценции в УФ свете), ГЖХ или ГЖХ с масс-спектроскопией. Подготовка образца ведется практически также, как и в случае охратоксинов. ПДК - 0,0050мг/кг = 5мкг/кг. Предел обнаружения до 1,5 мк/.кг.  

Трихотецены встречаются реже. Наиболее токсичным представителем группы трихотеценовых токсинов является Т2-токсин. Наиболее часто обнаруживаемым токсином этой группы является дезоксиниваленол (вомитоксин) – причина тяжелых токсикозов. Встречается впшенице, кукурузе, ячмене и других зерновых. Токсическое действие трихотеценовых токсинов характеризуется поражением кроветворных и иммунокомпетентных органов, анемией, поражением функций желудочно-кишечного тракта. Продуцируютсяя различными видами грибов рода Fusarium, Myrothecium  и др. и могут быть причиной отравлений человека. Опасность, которую трихотеценовые микотоксины представляют для здоровья человека, связана с повсеместной распространенностью грибов-продуцентов, преимущественно поражающих зерно и зернопродукты, и их высокой токсичностью. Методика определения трихотеценов содержит следущие стадии: -1)экстракция токсинов водным метанолом, 2)очистка и концентрирование экстракта, 3)хроматографирование в тонком слое силикагеля; 4) проявление цветных пятен при обработке пластин растворами алюминия, хромотроповой или серной кислот и облучение УФ-светом. Предел обнаружения – 0,05-0,1 мг/кг. Для определения трихотеценов в зерне и продуктах его переработки можно использовать микробиологический метод.