Клональное микроразмножение и оздоровление растений

Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Практически он мало используется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при частом пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями отмечаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. В то же время, некоторые недостатки этого метода в селекционной работе оборачиваются преимуществами.

Кроме того, в некоторых случаях он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру успешно размножаются сахарная свекла, злаковые, представители рода  Brassica, подсолнечник и другие культуры.

 

 

 

 

 

 

 

 

Оздоровление посадочного материала от вирусов методами химиотерапии и термотерапии. 
Одно из преимуществ клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала растений. Это можно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфекции. 
 
Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях растений впервые было высказано Чуигом в 1938 г. и Уайтом в 1943 г. Начиная с 50-х гг. предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстрорастущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия.  
 
Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время. Строение точки роста растений имеет свою специфику: средний диаметр дистальной ее части, представленной апикальной меристемой, у разных растений составляет до 200 мкм, высота - от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения. 

Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, не допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки.  
 

В принципе, возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие. 

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы, через их - на нуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности.  
 
Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температуре действует на вирусы через метаболизм растений. Под действием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет и наоборот.  
 
Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37 °С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру - 37 °С, освещенность лампами дневного света - 5 тыс. лк, фотопериод - 14-16 ч/сут при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %.  
 
Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10-12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 недель и более. Однако существуют растения, например, луковичные культуры, цимбидиум, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vitro. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro.  
 
Помимо положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект от воздействия высоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздика, хризантема, фрезия) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличивать коэффициент размножения на 50-60 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений.  
 
Использование термотерапии в сочетании с меристемной культурой дает возможность оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от вирусного хлороза, 90 % земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины, более 80 % картофеля. Растения на наличие вирусов, как правило, проверяют с помощью иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов. 

Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, - хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название - вирозол) концентрацией 20-50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия.  
 
При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных ме-ристемных растений увеличивался до 80 % по сравнению с 40 % на контроле. Положительные результаты получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Клональное микроразмножение декоративных, плодово-ягодных и хвойных растений.

Цветочные, плодово-ягодные культуры. Необходимость использования здорового посадочного материала в промышленном садоводстве, цветоводстве и лесном хозяйстве не вызывает сомнений. В настоящее время существует несколько методов получения оздоровленных растений: тестирование большого количества исходного растительного материала; размножение в условиях in vitro с последующим их тестированием; термотерапия или хемиотерапия, тестирование, размножение in vitro и снова тестирование.

Выбор метода зависит от вида вирусной инфекции, а также от генотипических особенностей исследуемых объектов. Трудоемкость проведения таких работ обусловила разработку индивидуальных методов размножения растений в условиях in vitro для каждого конкретного растения, относящегося к разным таксономическим группам. Основным методом, применяемым для сохранения и размножения ценных экземпляров, остается метод, основанный на снятии апикального доминирования. Из плодовых и ягодных культур подобным образом в промышленных масштабах размножают землянику, ежевику, малину, яблоню, сливу, вишню, подвои и скелетообразователи груши, а также некоторые декоративные культуры, такие, как сирень, жимолость, кизильник, роза, хризантема и др. Данный метод считается универсальным и имеет хорошую воспроизводимость результатов в пределах вида и рода растений; минимальную степень риска в отношении получения генетически неоднородного посадочного материала (Н.Е. Павловская и др., 1998).

Второй распространенный метод клонального микроразмножения для практических целей цветочно-декоративных культур и некоторых плодовых — развитие адвентивных почек/побегов. Как правило, в качестве первичного экспланта используют чешуи или сегменты базальной части донца луковиц, сегменты листовой пластинки и междоузлий побегов. Таким методом размножают, главным образом, луковичные цветочные культуры (гиацинты, лилии, гладиолусы, тюльпаны, нарцисы и др.).

В настоящее время в коммерческих целях метод клонального микроразмножения применяется для растений семейства Орхидных, для которых размножаемые растения являются сложными гибридами. Некоторые из них сочетают геномы трех-четырех разных родов. В обычных условиях осуществить вегетативное размножение этих растений сложно, а в случае завязываемости семян и их прорастания, растение достигает фазы цветения лишь через 3—5 лет.

В последние годы резко возрос спрос на многие цветочные и декоративные культуры. Вместе с тем некоторые ценные виды находятся на грани исчезновения и занесены в Красную книгу. Сокращение и размножение редких, исчезающих и декоративных видов растений возможно при помощи методов клеточной инженерии, и в частности клонального микроразмножения. На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева разработаны технологии быстрого размножения цветочных и декоративных растений в условиях in vitro. Создан банк редких, декоративных, цветочных и исчезающих видов растений, разработаны лабораторные технологии размножения декоративно-лиственных и красиво-цветущих бегоний (16 сортов), хризантем (10 сортов), гиацинтов (8 сортов), фиалок (12 сортов), эписций (6 сортов), лилий (20 сортов), гладиолусов, фритил-лярий и других растений.

Как правило, первичным эксплантом служат сегменты чешуи (луковичные культуры), листья (розеточные культуры) и пазушные почки (для растений с вертикальным ростом). Разработанные технологии позволяют в течение 1,5 — 2 месяцев получать на одном экспланте от 8 шт. (гиацинты) до 70 шт. (бегонии) адвентивных почек, способных впоследствии развиваться в нормальные растения. По предварительным расчетам можно получить в течение 6 месяцев 1250 микролуковиц фритиллярии (рябчик императорский) из 15 сегментов луковицы. В течение года из одной луковицы можно вырастить до 8 тысяч лилий. Эти технологии основываются на микрочеренковании или на индукции образования дополнительных почек или луковиц непосредственно на первичном экспланте.

Коммерческое микроразмножение растений становится быстрорастущим промышленным производством. Однако созданию коммерческих фирм-лабораторий должно предшествовать прогнозирование рентабельности и социальной необходимости производства данного вида продукции. Перед принятием решения по организации коммерческих лабораторий должны быть учтены такие факторы, как стоимость продукции, рыночная цена, емкость рынка, сезонность поставки, выбор сортов.

 

Промышленные культуры (млн шт.), выращенные in vitro в США, странах Азии и Европы в 2000 году

Культура	США	Европа	Азия
Цимбидиум гибридный (орхидея)	0,5	0,2	0,2
Бегония	2,5		—
Рододендрон	—	3,5	—
Гербера	2,5	-	0,5
Ирис гибридный	5,0	2,8	2,5
Папоротник	1,5	1,5	—
Фикус	1,7	4,5	-
Диффенбахия	6,0	—	—
Земляника	4,0	-	2,0
Картофель	7,0	—	—
Роза	—	5,7	—

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    Практический интерес представляют исследования, объектами которых являются зародыши плодовых растений раннего срока созревания. Объясняется это тем, что селекционно-генетическая работа с такими сортами затрудняется из-за формирования у них неполноценных семян с недоразвитыми зародышами, которые в обычных условиях не образуют всходы. Поэтому среди значительного числа сортов разных плодовых культур очень мало раннеспелых (Н.Е. Павловская, Л.В. Голышкин, Л.В. Голышкина, 1998). Во многих научно-исследовательских институтах по плодовым культурам разрабатываются методические приемы культивирования зародышей in vitro (например, для преодоления покоя семян черешни и персика), в результате чего из изолированных зародышей получают стерильные проростки (груша, миндаль, хурма, персик, черешня и др.), а также их межвидовые гибриды (например, миндаль и хурма), которые в дальнейшем размножают in vitro. Размноженные формы и ультраранние и ранние по срокам созревания сорта урожайные, с плодами хорошего качества, включаются в государственное сортоиспытание и районируются (например, персик сорт Пламенный).

Хвойные породы. Интерес к работе с хвойными породами вызван главным образом необходимостью сохранения генофонда некоторых пород, их декоративными свойствами и трудностью размножения черенками. Для можжевельника, например, применение клепального микроразмножения является наиболее перспективным способом, так как семена данной породы обладают низкой всхожестью, наблюдается дегенерация зародышей, а при черенковании процент укорененных черенков не превышает 5—8 %. Введение в культуру криптомерии и ее последующее размножение необходимо с целью получения достаточного количества посадочного материала, который используется главным образом для посадки в садах и парках, где она ценится из-за декоративных свойств. Хвоя криптомерии очень густая, обладает способностью изменять окраску в зимний период, что делает эту породу еще более привлекательной. Что же касается остальных пород, за исключением некоторых видов семейства сосновых, то размноженный посадочный материал в основном используется при озеленении городов.

В табл. 1 и 2 представлены некоторые древесные хвойные породы, для которых разработана техника культивирования изолированных тканей в условиях in vitro.

Таблица 1. Применение культуры тканей для размножения хвойных пород

Семейство, вид	Фаза развития первичного экспланта	Происхождение экспланта	Метод размножения	Укоренение
	Семейство Сосновые
Пихта бальзамическая	Взрослая	Побеги	1
Лиственница европейская	Ювенильная	Незрелые и зрелые зародыши, гипокотиль	1, 4
	Взрослая	Почки
Сукачева	»	Апекальные почки	1	+
даурская	»	Почки	1, 2	+
Псевдотсуга тисолистная	Ювенильная	Зародыши, семядоли, апекс проростка, гипокотиль	1, 4	+
	Взрослая	Почки, стебли	1, 2	+
Тсуга западная	Ювенильная	Семядоли	1
	Семейство Кипарисовые
Биота восточная	Ювенильная	Апекс проростка, гипокотиль	1
Кипарис лузитанский	»	Зародыши, семядоли, апекс проростка	1	+
Можжевельник многоплодный	Взрослая	Верхушка побега, стебель	1, 3
Туя
гигантская	Ювенильная	Апекс проростка	1, 2	+
	Взрослая	Верхушка побега	1. 2
западная	Ювенильная	Зародыш	1	+
	Взрослая	Верхушка побега	1
	Семейство Араукариевые
Араукария чилийская	Ювенильная	Гипокотиль	1, 3	+
	Взрослая	Стебель	1