Генная инженерия

     Генетическая  инженерия 

     История генетической инженерии 

     Генная  инженерия появилась  благодаря работам  многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики.

     На  протяжении многих лет  главным классом  макромолекул считали  белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.

     Лишь  в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак  Карти показали, что носителем  наследственной информации является ДНК.

     С этого времени начинается интенсивное  изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

     На  рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к  концу 60-х годов его универсальность  была подтверждена экспериментально.

     Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали  кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и  плазмиды.

     Были  разработаны методы выделения высокоочищенных  препаратов неповрежденных молекул  ДНК, плазмид и вирусов.

     ДНК вирусов и плазмид вводили  в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и  экспрессию соответствующих генов.

     В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения  ДНК. Особая роль в развитии методов  генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

     Историю развития генетической инженерии можно  условно разделить  на три этапа:

     Первый  этап связан с доказательством  принципиальной возможности  получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

     Второй  этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

     Третий  этап - начало работ  по включению в  векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.

     Формально датой рождения генетической инженерии  следует считать 1972 год, когда в  Стенфордском университете П. Берг и  С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

     Генетическая  инженерия

     Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который  нашел наибольшее практическое приложение, является генная инженерия.

     Генная  инженерия – это  сумма методов, позволяющих  переносить гены из одного организма  в другой, или –  это технология направленного  конструирования  новых биологических  объектов.

     Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка.

     Это дает возможность  детально анализировать  структуру и функции  белков и использовать их в качестве лекарственных  средств.

     В настоящее время  кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком  таких важных гормонов как инсулин и  соматотропин.

     Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной  железы животных, поэтому  стоимость его  была очень высока. Для получения 100г  кристаллического инсулина требуется 800-1000кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.

     Инсулин состоит из двух полипептидных  цепей А и В  длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин.

     Было  показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин  животных, а по биологической активности от него не отличается.

     Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого  гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в  неделю, то за год  ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.

     Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина  в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.

     Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью  бактерий, который был лишен перечисленных  недостатков. В 1982 году гормон роста  человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР.

Цели  и методы генетической инженерии

     Цель  прикладной генетической инженерии заключается  в конструировании  таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

     На  технологии рекомбинантных ДНК основано получение  высокоспецифичных  ДНК-зондов, с помощью  которых изучают  экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

     Технология  рекомбинантных ДНК  сделала возможным  нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

     Если  гибридную ДНК ввести в оплодотворенное  яйцеклетку, могут быть получены трансгенные  организмы, передающие мутантный ген  потомками.

     Генетическая  трансформация животных позволяет  установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.

     Технология  рекомбинантных ДНК использует следующие  методы:

• специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
• быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
• конструирование рекомбинантной ДНК;
• гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью;
• клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
• введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

     Ферменты  генетической инженерии

     Генетическая  инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты.

     Если  с клетками и клеточными органеллами  мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК.

     Только  ферменты могут найти определенные последовательности нуклеотидов, «разрезать»  там молекулу или, наоборот, «заштопать»  дырку в цепи ДНК.

     Эти ферменты издавна находятся в  клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки.

     Задача  генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

     Следует отметить, что ферменты, применяемые  в генной инженерии, лишены видовой  специфичности, поэтому экспериментатор  может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности.

     Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые  барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

     Ферменты, применяемые при  конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

• ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
• ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
• ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
• ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.