Тканевая оксиметрия

 Помимо указанных выше фракций гемоглобина в крови человека всегда присутствуют и другие его фракции – метгемоглобин (metHb), карбоксигемоглобин (HbCO) и др. (Транспорт CO2 осуществляется гемоглобином не напрямую, не в виде молекулы HbCO2, а через образование и накопление в эритроцитах ионов бикарбоната HCO3. Гемоглобин, связанный таким образом с CO2, называется карбаминогемоглобином или, упрощенно, карбогемоглобином ).При этом оксид углерода (угарный газ, CO) обладает гораздо большим сродством к гемоглобину, чем кислород, что обуславливает его сильное токсическое действие. Даже при низких концентрациях CO вытесняет кислород из соединения с гемоглобином, а гемоглобин теряет способность к переносу O2. Скорость соединения СО с Hb в 160 тысяч раз больше, чем скорость его отдачи. При наличии в воздухе СО происходит накопление в крови HbСО и нарушается транспорт кислорода по сосудам вследствие затрудненной отдачи гемоглобином СО и, соответственно, невозможностью присоединения к нему О2.

В норме же в капиллярах тканей HbO2 теряет О2, а основная часть восстановленного гемоглобина присоединяет к себе СО2, т.е. HbO2 переходит в Hb и карбогемоглобин. Эффективное отщепление О2 при относительно высоком его парциальном давлении возможно из-за сигмоидной (S-образной) формы кривой диссоциации кислорода (рис. 1), описываемой уравнением

Хилла. Сродство гемоглобина к кислороду определяется тремя основными факторами (концентрациями в среде): ионов водорода (рH), двуокиси углерода и 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ). К дополнительным факторам, влияющим на положение кривой на координатной плоскости, относится также температура . Увеличение значения кислотности (рH) плазмы или снижение температуры и уровня 2,3-ДФГ способствует увеличению сродства гемоглобина к кислороду (сдвиг кривой влево) и относительному уменьшению высвобождения кислорода при переходе от артериального парциального давления кислорода Ро2, равного, примерно, 95 мм рт. ст., до венозного Ро2, равного порядка 40 мм рт. ст. Напротив, уменьшение значения рH или повышение температуры и уровня 2,3-ДФГ сопровождаются уменьшением сродства гемоглобина к кислороду (сдвиг кривой вправо) и относительным увеличением его высвобождения .

Процентное содержание HbO2 на фоне общего суммарного количества гемоглобина в крови называется фракционным насыщением крови оксигемоглобином (frSO2) или степенью оксигенации крови (oxygenation of blood) . В англоязычной литературе этот параметр часто называют также фракционной сатурацией оксигемоглобина в крови, или просто сатурацией(saturation, SO2)  (все три названия эквивалентны). Согласно кривой диссоциации гемоглобина, этот параметр функционально однозначно связан с парциальным давлением кислорода в крови как растворенного газа, поэтому в качестве сленга практикующие врачи иногда говорят о сатурации кислорода в крови,

Рис. 1. Кривая диссоциации оксигемоглобина крови здорового человека . Устанавливает однозначную связь между степенью оксигенации и парциальным давлением кислорода в крови.

понимая под этим, тем не менее, именно фракционное насыщение крови оксигемоглобином, т.е. параметр SO2, а не Pо2.Если обозначить молярную концентрацию HbO2 в крови как CHbO2, а общую (суммарную) молярную концентрацию всех фракций гемоглобина в крови, включая и HbO2, как , то математически параметр frSO2 может быть записан в виде:

(1)

Помимо фракционной сатурации на практике часто выделяют еще функциональную сатурацию оксигемоглобина в крови (funSO2), которую определяют как процентное содержание оксигемоглобина на фоне суммы только оксигемоглобина и восстановленного гемоглобина (дезоксигемоглобина):

 (2)

Эти два параметра равны в предположении отсутствия в крови других фракций гемоглобина кроме HbO2 и Нb, поэтому часто передние индексы “fr” и “fun” в обозначениях сатурации оксигемоглобина в формулах опускают. Важность параметров сатурации для оценки тканевого дыхания и клеточного метаболизма в тканях не нуждается в пояснении в медицинской аудитории. Они отражают потенциал клеточного дыхания, и именно на их определение и нацелены сегодня все современные методы оптической оксиметрии.

В основе всех, как лабораторных (in vitro), так и неинвазивных (in vivo), методов оптической оксиметрии в медицине лежит разница в оптических свойствах, а, точнее, разница в коэффициентах поглощения света разных длин волн разными фракциями гемоглобина. Оптические свойства практически всех форм гемоглобина в той или иной степени различны. Сегодня они изучены достаточно хорошо, особенно спектры поглощения их суспензий в растворе гепарина с NaCl. Спектры поглощения оксигемоглобина (HbO2) и дезоксигемоглобина (Нb) для гемолизованной крови в видимом диапазоне спектра (рис. 2) сегодня входят практически во все учебники по физиологии. Например, на длинах волн 340, 410, 430, 450, 500, 569, 586 и 805 нм поглощение света этими формами гемоглобина практически одинаково.

Рис. 2. Спектры поглощения гемоглобина и оксиге-моглобина гемолизованной крови

Это – так называемые изобестические точки, которые выгодно использовать в качестве реперных, когда необходимо исключить разницу в измерениях, связанных с неодинаковым пропусканием света венозной и артериальной кровью. На длинах волн 470, 670 и 980 нм наблюдаются наибольшие различия в коэффициентах молярной экстинкции (см. ниже) для Hb и HbO2. Проводя измерения, например, одновременно на двух длинах волн 670 и 980 нм, можно попытаться сразу по разнице поглощений определить процент оксигенированной крови в пробе.

Соответствующий раздел физики, на котором базируются такие оптические измерения, называется фотометрией, или спектрофотометрией, если речь идет о разных длинах волн или разных спектральных диапазонах длин волн.

Фотометрия – основа методов оптической оксиметрии

В целом фотометрия в переводе с греческого (ϕωτοζ – свет и μετρεω – измеряю) – наука об измерении энергии света, или, более строго, оптического излучения (напомним, что оптическим считается диапазон длин волн от 200 нм до 1•106 нм, т.е. до 1 м ). Она изучает основные закономерности в изменении энергетических характеристик света (мощности, энергии) при отражении излучения от границы раздела сред, при поглощении света различными веществами, при рассеянии света средой в разные стороны и т.д. Это один из наиболее ста-рых и устоявшихся разделов физики, появившийся на свет в XVII–XVIII веках благодаря фундаментальным исследованиям таких классиков физики как Кеплер, Бугер, Ламберт, Бир и др. Однако первые фотометрические методы диагностики непосредственно в клиниках, в том числе и методы оксиметрии, стали появляться лишь в конце XIX – начале XX века, когда появились первые электронные приборы регистрации излучения, и удалось разработать принципы оптической денситометрии, флуорометрии, цветометрии, нефелометрии и т.д. Именно с этого момента начинается систематическое изучение медицинских аспектов применения оптического излучения в целях медико-биологической диагностики и, в частности, оксиметрии. И именно фотометрические методы, подчеркнем еще раз, лежат сегодня в основе большинства лабораторных методов медицинской диагностики in vitro. Чтобы понять физические принципы методов оптической оксиметрии, о которых идет речь, необходимо, прежде всего, вспомнить ос-новные законы и уравнения фотометрии. Основным энергетическим уравнением фотометрии является простейшее уравнение баланса энергии при падении света на какую-либо поверхность или среду : 

Фoλ = Фaλ+Фrλ+Фτλ (3)

где: Фoλ– поток излучения (лучистый поток) с длиной волны света λ, падающий на поверхность исследуемого объекта, а индексами а, r и τ обозначены соответственно поток, поглощаемый средой, отраженный ею в полупространство источника и пропущенный насквозь. Нормировка  на Фoλ приводит к определению основных фотометрических параметров среды распространения  излучения  и уравнению связи между ними: 

1 = aλ+rλ+τλ, (4)

где: aλ=Фaλ/Фoλ, rλ=Фrλ/Фoλи τλ=Фτλ/Фoλносят соответственно названия спектральных коэффициентов поглощения, отражения и пропускания для материала среды. В общем случае эти коэффициенты являются функцией длины волны λ, характеризуют оптикофизические свойства материала (вещества), из которого состоит исследуемый объект, и именно их определению для различных биологических тканей и сред и были в первую очередь посвящены все первые работы по биологической фотометрии (биофотометрии). При этом классическая фотометрия не разделяет терминологически отраженный поток Ф1rλ от внешней граничной поверхности среды и обратно рассеянный поток Ф2rλ (рис. 3), образовавшийся от внутренних многократных переотражений света на неоднородностях внутренней структуры среды. Оба потока в ней объединяются в единое понятие отраженного потока Фrλ что иногда приводит к досадным недоразумениям, касающимся напрямую и вопросов врачебной трактовки результатов оптической in vivo диагностики. Между тем, понятие рассеянного потока весьма важно в биологической оптике. Большинство мягких клеточных тканей, а также кровь и лимфа (лимфа – в меньшей степени) являются средами, обладающими сильным светорассеянием, подобно молоку или снегу. С одной стороны, сильное рассеяние мешает измерениям, усложняя расчетные модели и схемы, а, с другой, – делает прин-ципиально возможными все in vivo измерения с передней поверхности биоткани, широко ис-пользуемые сегодня в методах неинвазивной оптической оксиметрии (например, тканевой оксиметрии), лазерной доплерографии, оптической когерентной томографии и других неинвазивных оптических диагностических методах, за счет образования обратно рассеянного потока Ф2rλ из глубины биоткани.

Это же в общем случае можно сказать и о прошедшем биоткань насквозь потоке Фτλ.

Рис. 3. Общая схема взаимодействия оптического излучения с веществом

Он тоже, как правило, представляет собой два разных потока: поток света, прошедший насквозь объект практически без рассеяния (на рис. 3 не показан), и поток света, многократно рассеянный в биоткани, но вышедший из нее в том же направлении, что и поток без рассеяния. Поток в среде без рассеяния распространяется прямолинейно и ослабляется средой по известному всем со школьной скамьи экспоненциальному закону Бугера–Ламберта–Бира , так что суммарный коэффициент поглощения излучения в среде без рассеяния определяется уравнением (4), записанным в следующей форме:

aλ=1 – rλ-    , (5)

где = C•ε (λ) (6) называется погонным (транспортным) коэффициентом поглощения излучения, являющимся функцией длины волны λ, ε (λ) – коэффициент молярной (погонной) экстинкции вещества (также зависит от выбранной λ); C – молярная (погонная) концентрация вещества на единице длины пути луча; x – длина пути излучения в об-разце вещества. Это уравнение в части определения концентрации вещества C в кюветах с растворами используется сегодня повсеместно в клинической лабораторной диагностике и дает врачам основную массу биохимических анализов (показателей) на основе изучения характерных спектров поглощения ряда органических и неорганических веществ. Главной целью такой диагностики является определение наличия и концентрации того или иного вещества в представленном биоптате, например, гемоглобина крови. Измерения в большинстве случаев проводят в проходящем свете и определяют сначала либо оптическую плотность вещества в кювете D(λ) для выбранной длины волны λ в сравнении со стандартными образцами оптической плотности, а затем по соотношению:

D(λ)=lg(1/τ (λ))        (7)

вычисляют коэффициент пропускания света τ (λ) через слой биоптата, либо сразу измеряют τ (λ) по отношению исходного и прошедшего кювету насквозь потоков излучения, а уже на основе клас-сического экспоненциального закона:

 τ (λ)=    (8)

и соотношения (6) при x=1 см (размер стандартной фотометрической кюветы), а также известном табличном значении ε (λ) искомого вещества, определяют молярную (погонную) концентрацию С этого вещества в кювете.Однако классические соотношения (5), (6)и(8) справедливы только для достаточно прозрачных сред без внутреннего светорассеяния. Наличие рассеяния в среде, когда среда становится мутной, существенно усложняет все расчетные формулы и делает нецелесообразным их рассмотрение в этой статье. Этому посвящены отдельные монографии, достаточно серьезные, причем далеко еще не все проблемы в этих теориях решены до конца. К счастью, для понимания базовых физических принципов оптической оксиметрии, включая и все методы неинвазивных (in vivo) измерений (оптической пульсоксиметрии и тканевой оксиметрии), приведенных выше сведений и соотношений вполне достаточно. Надо их только обобщить на случай многокомпонентной биологической среды, когда в среде присутствует не одно, а несколько определяемых веществ, и добавить к ним некоторые дополнительные и принципиально важные замечания по поводу понятия “глубины проникновения излучения” в биоткань.  Если среда является многокомпонентной, и в ней содержится не одно, а целый набор веществ, и каждое вещество вносит свой отдельный вклад в общее поглощение излучения сре-дой (биотканью) на выбранной длине волны λ, то в этом случае транспортный коэффициент поглощения биоткани будет уже представлять собой, в отличие от (6), не простую, а до-статочно сложную функцию – сумму вкладов от поглощения света каждым отдельным компо-нентом среды:

  (9)

где (λ) – коэффициент погонной (молярной) экстинкции для i-го биохимического компонента среды, а Сi – погонная (молярная) концентрация i-го компонента внутри тестируемой области. Вычленить отсюда каждое отдельное по результатам измерений (вычислений) только одного на одной длине волны уже не представляется возможным. Необходимо уже иметь определенный набор (массив) данных измерений, например, на разных длинах волн (j=1,2…i), для того чтобы получить замкнутую систему независимых линейных уравнений и решить ее относительно всех присутствующих веществ и их концентраций . Именно такой подход реализуется сегодня в подавляющем большинстве случаев в разных методах оптической оксиметрии. В простейшей модельной расчетной схеме среда распространения излучения, скажем, чистая кровь в кювете, может быть представлена как 2-компонентная жидкость-раствор, содержащая в себе непоглощающий свет растворитель-основу и только две растворенные в ней основные фракции гемоглобина – оксигенированную фракцию (HbO2) и восстановленную (Hb), т.е. деоксигенированную. В этом случае для двух разных длин волн λ1 и λ2 мы будем иметь систему из двух линейных алгебраических уравнений:

(10)

которая при экспериментально измеренных и и известных из литературы и легко решается относительно двух не-известных концентраций CHb и . Это позволяет легко найти процент оксигенированной фракции гемоглобина в крови, который соответствует, в общем случае, функциональной сатурации по формуле (2). Оптические измерения в неинвазивной оксиметрии, направленные на определение и по (10), можно проводить как в отраженном, так и в прошедшем свете (рис. 4). В общем случае в приборе (оксиметре) излучение от источников света 1, доставляется к обследуемому органу 2 через оптическое волокно 3. С помощью приемного оптического жгута 4 регистрируемые световые потоки доставляются в блок регистрации излучения 5.

Рис. 4. Реализация методов неинвазивной оптической оксиметрии в отраженном (а) и прошедшем (б) свете. Пояснения в тексте

Этот блок содержит, как правило, оптические фильтры и набор фотоприемников на разные длины волн. Далее полезный электрический сигнал проходит аналоговую обработку (усиление, фильтрацию) в электронном блоке 6, оцифровывается и передается в компьютер 7 для дальнейшей математической обработки (реализации вычислений).В ряде случаев, как, например, в пульсоксиметрах с пальцевым датчиком-прищепкой (см. ниже), источники излучения (светодиоды) и фотоприемник (фотодиод) располагаются не-посредственно на поверхности обследуемой биоткани. В этом случае световоды для транспортировки излучения не используются, а жгуты 3 и 4 представляют собой один электрический кабель. По результатам измерений блоком регистрации мощности излучений на разных длинах волн в программном обеспечении прибора реализуется вычисление транспортных коэффициентов и , по которым на ос-новании (10) и (2), например, для 2-компонентной среды, вычисляется funSO2 в тестируемом объеме биоткани. Следующий вопрос – вопрос о глубине проникновения излучения в биоткань. Если для случая “б”, скажем, для пальца руки почему-то не возникает обычно вопроса, что свет может проходить сквозь палец толщиной примерно 1см (как и сквозь кювету с кровью), и регистрироваться фотоприемным устройством, то для случая “а” практически каждый раз этот вопрос требует пояснений для врачей. Дело в том, что в современной медицинской литературе, особенно в многочисленных публикациях по модной сегодня лазерной терапии, часто можно встретить всевозможные таблицы и схемы, “разъясняющие” врачам, на какую глубину в живые биологические ткани, например, в кожу проникает лазерное излучение разных длин волн в видимом и ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне спектра. И в этих публикациях часто делается вывод, что свет, скажем, синего или зеленого диапазонов видимого спектра проникает в кожу или кровь на глубину лишь в доли миллиметра. Соответственно, реализация измерений по схеме рис. 4б не позволяет эффективно диагностировать микроциркуляторное русло в коже, которое залегает глубже. Но это заблуждение. Авторы подавляющего большинства всех этих публикаций исходят из предположения об отсутствии рассеяния света в среде и используют классическое определение глубины проникновения x излучения в какую-либо среду на основе простого соотношения: