Светящиеся бактерии и биолюминесценция

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ФГБОУ ВПО «УФИМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НЕФТЯНОЙ

ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

 

 

КАФЕДРА БИОХИМИИ И ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОИЗВОДСТВ

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

на тему:

СВЕТЯЩИЕСЯ БАКТЕРИИ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

 

 

 

 

 

ВЫПОЛНИЛ:                                                                              СТ. ГР. БТБ-11-01

К.В. ГЕЛЬМЕЛЬ

ПРОВЕРИЛ:                                                                     СТ. ПРЕПОДАВАТЕЛЬ

                                                                                                  Л.М. СУЛТАНОВА

 

 

 

 

УФА 2013.

Содержание

С.

Введение                                                                                                                   3

1 Светящиеся бактерии                                                                                           4

1.2 Физиологические свойства                                                                          4

1.3 Спектр и интенсивность эмиссии света                                                    7

2 Люминесцентная система  бактерий                                                                   8

2.1 Контроль за синтезом и активностью люминесцентной системы          8

2.2 Электронтранспортные цепи  люминесцентных бактерий и локализация люминесцентной системы.                                                              8

2.3 Реакция биолюминесценции                                                                     10

3 Культивирование и использование люминесцентных бактерий                   12

Заключение                                                                                                             14

Список использованной литературы                                                                   15

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что светят абсолютно все живые организмы. Способны к свечению и все бактерии. Это свечение по своей природе является биолюминесценцией.

Биолюминесценция широко распространена среди организмов: от высших до бактерий. Люминесцентные бактерии — один из самых многочисленных одноклеточных обитателей морей и океанов. Они не способствуют «фосфоресценции» морей, но очень важны в общей экологии морских организмов. Исследователи концентрируют внимание на эффективном процессе непосредственной трансформации химической энергии в световую. Многое известно о физиолого-биохимических свойствах люминесцентных бактерий и о свойствах бактериальной люциферазы — фермента, осуществляющего образование квантов света при окислении восстановленных химических соединений. Прогресс в этих областях за последние 20 лет несомненен и связан как с относительной легкостью регистрации активности фермента, так и с привлечением современных физико-химических методов: ЯМР, масс-спектроскопии и других. Вместе с тем нерешенными остаются многие вопросы и особенно главные: как устроена люминесцентная система бактерий, каким образом происходит генерация квантов света и для чего бактерии светят?

В последние годы радикально меняются представления о люциферазе. Господствовавшие долгое время взгляды на фермент, как на очень просто устроенный белок под натиском новых и переосмысленных старых экспериментальных данных уступают место более очевидным концепциям о необходимости белок-белкового взаимодействия для эффективной генерации квантов света. Новые взгляды стимулируют интерес к бактериальной биолюминесценции.

Повышение   интереса   к   бактериальной     биолюминесценции связано также и с тем, что этот феномен на наших глазах трансформируется   в   весьма   перспективный   аналитический   метод. Субстратами для люминесцентной системы служат  пиридиннуклеотиды,  флавины,  алифатические  альдегиды  и  кислород, т. е. соединения, занимающие ключевые позиции в метаболизме клеток.  В сочетании с  современным   аппаратурным оснащением   регистрации  квантов света это создает благоприятные возможности для применения  метода  в   различных  областях  биотехнологии.  

Интерес к бактериальной биолюминесценции для энзимологов можно видеть и в том, что рассматривается не некая уникальная ферментная система, а монооксигеназа, одним из продуктов реакции которой является квант света. Чувствительная и объективная оценка активности такого фермента возможна при концентрациях субстратов и кофакторов, недоступных для других ферментов и вместе с тем близких к внутриклеточным.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. СВЕТЯЩИЕСЯ БАКТЕРИИ.

Самые мелкие живые излучатели — это светящиеся бактерии. По современной классификации светящиеся бактерии относятся к родам Photobacterium, Vibrio, Lucibacterium.

Люминесцентными видами рода Photobacterium являются:

P. phosphoreum и P. leiognathi.

Люминесцентными видами рода Vibrio являются:

V. fischeri, V. logei, V. harveyi, V. splendida.

 

1.2 Физиологические свойства                                                                         

Светящиеся бактерии, обитающие свободно в морской воде, относятся к сапрофитам: они питаются органическими веществами, растворенными в морской воде, разлагают остатки умерших животных и растений, часто поселяются па мертвой рыбе и кальмарах. В тропиках, например, достаточно оставить па ночь в банке с морской водой мертвого кальмара, чтобы утром почти наверняка найти его ярко светящимся от размножившихся бактерий. Некоторые светящиеся бактерии поражают ракообразных — креветок. Среди них известны немногочисленные формы, которые могут жить в теле лягушек, личинок комаров. Заболевшие животные становятся светящимися и продолжают светиться некоторое время после гибели.

Недавно было обнаружено, что ферменты светящихся бактерий способны разлагать одно из самых устойчивых веществ биологического происхождения — хитин. В хитиновый панцирь одеты ракообразные, которые составляют большую часть живой массы в океане. Хитиновые скелеты отмерших рачков непрерывным дождем оседают па дно. Разлагая эти остатки, светящиеся бактерии возвращают их вещество в океан и играют таким образом существенную роль в круговороте веществ.

Все люминесцентные бактерии являются грамотрицательными подвижными палочками, факультативными анаэробами, способные расти в зависимости от вида в широком интервале температур (от 4 до 35а) на глюкозе, маннозе, галактозе, фруктозе, глицерине и продуцировать внеклеточную хитиназу .

Клетки V. fischeri содержат желтый пигмент и имеют форму палочки с пучком жгутиков. P. phosphoreum и P. leiognathi. таксономически подобны и различаются по оптимальной температуре роста. P. phosphoreum отличаются инкубацией при низких температурах (4°С), и их рост часто тормозится при температурах свыше 25°, P. leiognathi хорошо растут при температуре до 35° и обычно обнаруживаются в тропических водах. Но встречаются бактерии, светящиеся при температуре, близкой к нулю. Такие формы были выделены экспедицией лаборатории фотобиологии Института физики им. Л. В. Кирепского из вод Охотского моря. Возможно, что именно они вызывают известное по описаниям полярников свечение морского льда. Культуры являются облигатными морскими формами со специфической потребностью в ионах натрия. Бактерии представляют собой короткие палочки с полярными жгутиками.

Болезнетворных форм среди светящихся бактерий мало, поэтому для человека они безопасны.

Совершенно особая и в высшей степени интересная группа морских светящихся бактерий — это симбионты — сожители рыб и головоногих моллюсков. Их открыл итальянский микробиолог У. Пьерантони. Он обнаружил, что некоторые рыбы имеют органы свечения, по сами не способны генерировать свет. Их световые органы представляют собой настоящие культиваторы для бактерий. Кровеносная система рыбы снабжает бактерии питательными веществами, выводит продукты обмена веществ, доставляет кислород, к содержанию которого бактерии очень чувствительны. Это обстоятельство используется рыбой для управления свечением: сжатие сосудов перекрывает поток крови, и при отсутствии кислорода, свечение бактерий затухает, расширение сосудов вызывает вспышку свечения.

3. Спектр и интенсивность эмиссии света       

Спектр эмиссии большинства люминесцентных бактерий характеризуется отдельной широкой полосой с пиком 490—495 нм. P. phosphoreum проявляет явный сдвиг в голубую область с максимумом 465 или 478 нм.

Обычно спектр эмиссии живой клетки совпадает с таковым в реакции люциферазы искусственно созданной в лабаратории, но встречаются и исключения. Так, спектр эмиссии люциферазы P. phosphoreum характеризуется максимумом, сдвинутым в красную область по сравнению с клетками на 25 нм .

Спектры свечения бактерий не изменяются с возрастом культуры и не зависят от температуры, рН, солевого состава среды, в отличие от интенсивности свечения бактерий, которая зависит от внешних факторов: температуры, рН, аэрации, гидростатического давления, состава среды.

Люминесцентные бактерии являются самыми маленькими источниками биолюминесценции. Энергия свечения одной бактерии определена в 5 10-10 мкВт/см2 при 510 нм, что эквивалентно 1,9 10-14 энергии свечи. Наиболее яркие штаммы люминесцентных бактерии излучают 103 -104 квант/с кл .

 

 

 

 

 

2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ СИСТЕМА БАКТЕРИЙ.

2.1 Контроль за синтезом и активностью люминесцентной системы.

Синтез люминесцентной системы сильно регулируется составом среды. В минимальной среде все компоненты определены и ингибиторы, присутствующие в комплексной среде, отсутствуют.

Растущие бактерии выделяют в среду активатор, воздействующий на ген люциферазы и запускающий ее синтез. Для проявления его действия обязательно присутствие в среде аминокислоты — аргинина.

Кислород важен не только как субстрат реакции, но и как контролирующий агент в синтезе люциферазы. Поскольку люцифераза имеет очень высокое сродство к кислороду, кислород может лимитировать аэробный рост люминесцентных бактерий при концентрациях, вполне достаточных для высокой активности люциферазы.

При концентрациях О2, лимитирующих рост бактерий, синтез люциферазы может также лимитироваться, в других видах клетки развиваются с высоким содержанием люцеферазы. Первая группа, в которой имеется тесная связь между ростом и синтезом люциферазы, включает V. harveyi и P. Leiognathi. Лимитированная по кислороду культура образует столько люциферазы на единицу биомассы, сколько и нелимитированная. Для культур P. phosphoreum и V. fischeri при низких концентрациях О2 синтез люцеферазы не лимитирован и клетки содержат большое количество фермента. Считается, что эти отличия в реакции на содержание 02 связаны с экологическими особенностями обитания различных видов. Сложная регуляция свидетельствует о том, что светоизлучающая система находится под контролем управляющих механизмов клетки.

 

2.2 Электронтранспортные цепи люминесцентных бактерий и локализация люминесцентной системы.

 Бактериальная биолюминесценция — это окислительный процесс, который сопровождается потреблением кислорода. Раньше, исследователи считали, что люминесценция есть простое последствие дыхания .

Соотношение между люминесценцией и парциальным напряжением О2 в растущей культуре исследовалось и было покапано, что скорость потребления О2 проточной культурой при 250 С равна 8,3-10-2 мкл/ч па 1 млн клеток. Однако наиболее важно знать, сколько кислорода, поглощенного люминесцентными бактериями, идет на светопродуцирующую реакцию.

Таким образом, очевидность существования конкуренции за потребление кислорода геминовой и люминесцентными системами не вызывает сомнения.

Важно отметить, что лишь незначительное количество О2, потребленного в «световом» дыхании, используется в самом процессе светоизлучения. Большая часть 02 может быть вовлечена в обратимое окисление люциферина, не сопровождающееся образованием квантов.

Взаимоотношение двух систем можно отразить в виде схемы:

2.3 Реакция биолюминесценции

На первой стадии реакции происходит восстановление субстрата с последующим энзиматическим окислением.

Реакции этого типа характеризуются тем, что стадия восстановления субстрата непосредственно предшествует светоизлучающему окислению или же сопровождает его. Такая реакция лежит в основе свечения бактерий. Она представляет собой ферментативное окисление люциферина, роль которого у бактерий играет восстановленный флавинмононуклеотид (FMN-Н2). Люцифераза — фермент реакции — выделен у бактерий. Помимо люцифе-разы, люциферина и кислорода, для успешного получения в пробирке бактериальной биолюминесцентной реакции необходим альдегид с числом углеродных атомов не менее семи; эффективнее всего альдегиды с цепочкой из 11 — 13 углеродных атомов.

Восстановление флавинмононуклеотида происходит в реакции с восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (NAD-Н2) в присутствии фермента дегидрогеназы. Так как NAD-Н2 образуется в ходе клеточного окисления пищевых веществ у бактерий, можно понять, каким путем энергия клетки передается светоизлучающей системе. В самом общем виде его можно выразить такой схемой:

При этом FMN-Н2 вместе с люциферазой и альдегидом образует комплекс, который может существовать десятки секунд в растворе при комнатной температуре, а при температуре жидкого азота сохраняется неопределенно долго. Время его существования в клетке не известно. Недавно удалось зарегистрировать свечение от одиночной бактериальной клетки.

До настоящего времени в литературе продолжается спор о роли альдегида в свечении бактерий. Согласно предположению, развиваемому американским биохимиком Ли, окисление альдегида в кислоту дает энергию биолюминесцентной реакции.

Механизм биолюминесцентной реакции не может быть понят, пока не станет ясна роль фермента этой реакции — люциферазы в высокоэффективном превращении химической энергии в световую.

Сведения об этой молекуле еще далеко не полны. Установлено, что люцифераза имеет молекулярный вес, близкий к 80000, и является димером, т. е состоит из двух субъединиц, которые можно разделять и вновь реконструировать в активную люциферазу.

Люцифераза не содержит металлов: в се составе восемь свободных сульфогидрильных групп, но нет дисулъфидных связей.

При интенсивном свечении количество люциферазы в клетке может достигать 5% всего белка.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ.

Люминесцентные бактерии могут быть выделены из морской воды или из морских обитателей. Обычными микробиологическими методами получают чистые культуры этих организмов. Культивирование люминесцентных бактерий не представляет особых трудностей, для их роста требуется сравнительно простая питательная среда, необходимо лишь соблюдать все условия, касающиеся их питания, рН среды и температуры.