Реконструкция клеток путём микрохирургии

Федеральное Агентство Науки и Образования.

Сибирский Федеральный  Университет.

Институт  Фундаментальной Биологии и Биотехнологии.

Кафедра биотехнологии. 
 
 
 
 
 
 
 
 

РЕФЕРАТ 
 

На тему:  Микрохирургия. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    
 
 
 
 

Красноярск, 2008г. 

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………3

РЕКОНСТРУКЦИЯ  КЛЕТОК - ВАЖНЫЙ ПРИЕМ В РЕШЕНИИ МНОГИХ ЗАДАЧ БИОЛОГИИ……………………………………………………………………...4

СЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН …………………………………………….......7

МЕТОД ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО  СЛИЯНИЯ ПРИ РЕКОНСТРУКЦИИ ЖИВОТНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК………………………………………….8

РЕКОНСТРУКЦИЯ ЗИГОТ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ СОЧЕТАНИИ МИКРОХИРУРГИИ И ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО СЛИЯНИЯ КЛЕТОК.....13

ПЕРСПЕКТИВЫ МЕТОДА…………………………………………………………….19

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………..21

ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………………………...22 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ

      МИКРОХИРУРГИЯ (греч, mikros малый + хирургия) - направление в хирургии, сочетающее обычные хирургические приемы и технику операций под микроскопом с использованием специальных миниатюрных инструментов и тончайших атравматических игл с впаянными в них нитями.

      Экспериментальные методы стали применяться цитологами уже во второй половине прошлого столетия. Первые микрооперации проводились на сравнительно крупных объектах, например на развивающихся клетках различных животных, без использования каких-либо специальных приспособлений и при небольших увеличениях лупы или препаровального микроскопа. Микрооперации на отдельных клетках мелких размеров стали проводить только в начале XX столетия, когда был сконструирован прибор, называемый микроманипулятором. Микроманипуляторы позволяют проводить очень тонкие операции над клеткой и ее органоидами. Для этих операций требуются большие увеличения микроскопа и специальные микроинструменты, которые чаще всего изготовляются самим экспериментатором из тонких стеклянных нитей или палочек. Методы микрургии широко применяются и для выделения тканевых клеток или одноклеточных органоидов при переносе их в новую культуральную среду или в организм животного, что особенно важно для получения клонов. Наконец, к числу сложных микрургических операций, которые начали применяться сравнительно недавно, относится извлечение и трансплантация ядер, ядрышек и других органоидов клетки. Для этих операций пригодны главным образом крупные клетки простейших и других одноклеточных организмов, а также и крупные клетки некоторых многоклеточных животных, например амфибий. Операции по пересадке ядер дают возможность изучить роль ядра и цитоплазмы в жизни клеток, изучить изменения, происходящие в безъядерных клетках, выяснить участие ядра и цитоплазмы в передаче по наследству тех или иных признаков.

      РЕКОНСТРУКЦИЯ  КЛЕТОК  - ВАЖНЫЙ ПРИЕМ  В РЕШЕНИИ МНОГИХ ЗАДАЧ БИОЛОГИИ.

      За  последние 15 лет активно развиваются  работы по реконструкции  клеток, причем число публикаций лавинообразно нарастает. И это естественно, так как реконструируемые  клетки, формируемые из ядра и цитоплазмы различного происхождения, могут использоваться для решения большого количества важнейших биологических проблем. В настоящий момент проблема клеточной реконструкции вступает в новый этап в связи с появлением нового эффективного физического метода - электростимулируемого слияния  клеток.

      Реконструкция эмбриональных  клеток  и проблемы биологии развития. Реконструкция эмбриональных  клеток, по существу включает в себя такую важную задачу биологии развития, как механизмы реализации генетической информации. Это направление призвано решить такие важные проблемы как исследование реальной тотипотентности генома  клеток  разного уровня дифференцировки, способность геномов к репрограммированию, исследование подходов к получению отцовских и материнских копий или клонированию, получению гибридных животных и межвидовых химер путем искусственного слияния геномов и создания реконструированных зигот и ранних эмбрионов. Реконструкция эмбриональных клеток  позволяет взглянуть на взаимодействие ядра и цитоплазмы, рецепторных структур мембраны и генома. Особое место занимают опыты по пересадке ядер опухолевых  клеток  в энуклеированные яйцеклетки. Реконструкция эмбриональных  клеток  открывает возможность для изучения роли внеядерной наследственности в развитии.

      Реконструкция дифференцированных  клеток  и проблемы цитологии. Подобные приемы реконструкции весьма важны для выяснения механизмов деления, в частности механизмов активации хроматина при реконструкции  клеток  из предшественниц, находящихся на разных стадиях митотического цикла. Эти исследования помогают выявить механизмы корреляции тех или иных свойств  клеток, например взаимосвязь между увеличением способности клетки  к метастазированию и злокачественному росту с уменьшением способности к формированию межклеточных диффузионных каналов. Наконец, они важны для изучения механизмов старения  клетки.

      Реконструкция  клеток  и проблемы реализации генетической информации криоконсервированных геномов исчезающих видов животных. При существующих методах криоконсервации и размораживания различных клеточных структур (гаметы, гонады, зародыши) в 30-50% случаев повреждается цитоплазматическая мембрана. Цитоплазматическая мембрана может также нарушаться при перекисном окислении мембранных липидов. Вместе с тем неоднократно указывалось, что хромосомы гораздо устойчивее к процессам замораживания и размораживания. В этой связи очень существенна проблема замены поврежденной клеточной оболочки на клеточную оболочку зиготы от другого, но близкого вида. В ряде случаев очень важна возможность пересадки отдельных хромосом, например при необходимости переопределения пола. Подобные же проблемы встают при решении задачи о роли материнской цитоплазмы для развивающихся организмов. Здесь интересны разработки методических приемов по замене цитоплазмы в целом и ее отдельных элементов. Особенно интересны указанные задачи в связи с реализацией генетической информации криоконсервированных геномов при межвидовых трансплантациях ядер. Также важны задачи по получению межлинейных и межвидовых химер путем замены одного ядра в одной из  клеток  на стадии двух бластомеров. Получение подобных химер может содействовать преодолению при межвидовой трансплантации эмбрионов несовместимости реципиента и донора.

      Реконструкция  клеток  и биотехнологические задачи. В первую очередь имеются в виду такие комбинации частей реконструированной  клетки, когда можно будет получать  клетки-продуценты, способные к активному синтезу тех или иных ценных биотехнологических препаратов. Для решения различных задач физиологии  клетки  очень важно получение химер на клеточном уровне, когда искусственно создаются  клетки  с таким сочетанием свойств, которое не встречается в естественных условиях. Например, сочетание очень больших размеров  клетки, что создает хорошие условия для физиологического анализа, с синтезом мембранных рецепторов, ионных каналов и т. д., наличие которых характерно лишь для мелких  клеток, труднодоступных для физиологического анализа. Кроме того, уже описанные возможности при использовании реконструированных  клеток, в частности зигот животных, или камбиальных клеток  растений, позволяет подойти к клонированию ценных для сельского хозяйства особей. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

      СЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН.

      В большинстве случаев необходимым  завершающим этапом для получения  реконструированных  клеток  является процесс слияния основных исходных элементов - цитопласта и кариопласта. Хорошо известно, что при энуклеации  клеток после обработки их цитохалазином В с последующим выделением ядра, центрифугированием или микрохирургией  выделенное ядро всегда окружено цитоплазмой и поверхностной мембраной, т. е., при этом всегда формируется кариопласт. В то же время безъядерная часть клетки также сохраняет непрерывную целостность поверхностной клеточной мембраны и образует цитопласт. Таким образом, при искусственном отделении ядра от цитоплазмы всегда происходит по существу деление  клетки, т. е. цитоплазмы разделяющихся частей всегда остаются полностью отделенными от наружной среды клеточной мембраной.

      Это, по-видимому, главное условие удачной  изоляции ядер от цитоплазмы для большинства  клеток  животного происхождения (у которых линейные размеры не превышают 100-150 мкм). Всякое нарушение  непрерывности поверхностной клеточной мембраны при энуклеации, как правило, приводит к гибели  клетки  в связи с резким нарушением клеточного гомеостаза. Исключительно благоприятная роль цитохалазина В в резком повышении клеточной устойчивости к механическим повреждениям в процессе энуклеации, вероятно, определяется, главным образом тем, что за счет деконденсации микрофиламентов клеточного цитоскелета резко повышается автономность, а в силу этого, пластичность и адаптивность поверхностной клеточной мембраны к различным механическим повреждениям.

      Итак, изоляция ядер, как правило, - процесс  искусственного клеточного деления. Это, в свою очередь, означает, что реконструкция  новой  клетки  из цитопласта и  кариопласта возможна только при  истинном слиянии клеточных мембран, при котором вновь формируется единый объем. Без такого процесса реальная реконструкция клеток  невозможна.

      МЕТОД ЭЛЕКТРОСТИМУЛИРУЕМОГО  СЛИЯНИЯ ПРИ РЕКОНСТРУКЦИИ  ЖИВОТНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ  КЛЕТОК.

      Проблема микрохирургии клеток с помощью электростимулируемого слияния - бурно развивающееся направление. Ее рождение связано с работой Сеида и др., выполненной в 1979 г. В этой работе было показано, что при пропускании тока через внутриклеточные электроды, введенные в два соседних протопласта, может происходить их слияние. А уже через несколько лет вышли обзоры по данному вопросу. В них рассмотрено уже множество работ по электрослиянию. Правда, больше половины из них вышло из лаборатории Циммермана, родоначальника и одного из активных пропагандистов этого метода. К настоящему времени количество подобных работ резко увеличилось. Разработка метода и его использование охватывает все новые и новые лаборатории мира.

      У нас в стране инициаторами данного  интересного направления явились  сотрудники лаборатории, руководимой Ю. А. Чизмаджевым в Институте электрохимии АН СССР. Этому способствовали, во-первых, проводимые в лаборатории теоретические и экспериментальные исследования по механизмам электропробоя искусственных и естественных мембран, явления, несомненно, лежащего в основе процесса электрослияния; во-вторых, теоретические и экспериментальные разработки непосредственно по проблеме электрослияния мембран. Соответствующие публикации и тесные научные контакты сотрудников Института электрохимии с биологическими институтами способствовали использованию метода электростимулируемого слияния  клеток  для их реконструкции в других лабораториях страны

      В упомянутом обзоре рассмотрены работы, в которых показано, что слияние клеток  с помощью электрического стимула - явление довольно универсальное. Так, было показано, что при наложении импульсов электрического поля длительностью в 40 мкс и амплитудой 4-6 кВ/см на суспензию микроорганизмов Dictyostelium discoideum приводит к их слиянию и появлению значительного количества многоядерных  клеток  (до 40 ядер). Важно подчеркнуть, что эти клетки  не удается сливать двумя широко распространенными для слияния методами: поли-этиленгликолем и вирусом Синдай. В других работах было показано, что аналогичный прием по электростимуляции суспензии  клеток  приводит к увеличению частоты слияния протопластов дрожжей. При этом отмечается, что слившиеся  клетки  способны к делению.

      В описанных работах, а также многих других проводили слияние клеток  в суспензии. В данном случае предварительно перед сильным импульсом тока, вызывающим слияние, необходимо каким-либо способом вызвать агрегацию  клеток , чтобы  клетки  контактировали друг с другом. Для этих целей широко используется метод диэлектрофореза, при котором клетки  в случае достаточно высокой их концентрации в растворе, плотно контактируют друг с другом и создают цепочки клеток  вдоль силовых линий неоднородного высокочастотного электрического поля. Интересны различные модификации указанного подхода. Так, при слиянии клеток  миеломы и лимфоцитов мышей вначале с помощью диэлектрофореза формировали монослой  клеток  миеломы с помощью специальной формы платинового электрода, а затем в ячейку вводили лимфоциты. При этом установлено, что возникающие после электрослияния  клетки-гибриды  хорошо растут.

      Для получения соматических гибридов при  электростимуляции были использованы и другие приемы: создание плотной  суспензии с помощью центрифугирования, стимулирование адгезии с помощью различных химических агентов, культивирование клеток  в монослое, где естественным образом формируются межклеточные контакты, на электропроводящей подложке.

      В некоторых работах было специально проведено сравнение эффективности электрослияния фибробластоподобных  клеток  при различных способах достижения мембранного контакта: 1) посредством диэлектрофо реза  клеток  в переменном электрическом поле, 2) с помощью центрифугирования и образования плотного клеточного осадка, 3) путем выращивания  клеток  на проводящей подложке и формирования двойного клеточного слоя. Показано, что наиболее эффективным оказался третий способ (индекс слияния 50-70%) и практически неэффективным - первый. Авторы объясняют это возникновением в условиях естественного формирования двойного клеточного слоя (по данным электронной микроскопии) обширных межклеточных контактов, что повышает вероятность слияния при воздействии поля. Однако использование этого способа возможно только для  клеток, способных к росту и формированию контактов, поэтому авторы предполагают, что наиболее универсальным может оказаться второй способ получения мембранных контактов.

      Другой важный вопрос состоит в подборе оптимальной межклеточной среды, в которой проводится электрообработка  клеток. Так, имеются указания, что присутствие в среде одновалентных ионов в концентрации выше 20 мМ значительно понижает эффективность электрослияния. Однако в одной из работ убедительно показано, что ионная сила раствора не влияет на величину нарушения барьерных свойств мембраны при электрическом пробое, а, по-видимому, изменяет характер контактов между мембранами. В случае наличия хороших контактов между фибробластами, когда они растут на плоской подложке, наблюдается высокий индекс электрослияний при концентрациях Nad или КCl, достигающих 140 мМ.