Мониторинг загрязнения водной среды реки Херота с помощью методов биоиндикации

Оптимальная плотность  культуры — 25 половозрелых самок в 1 л воды. Раз в 7—10 сут. половину объема воды в сосуде с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотности культуры ее прореживают. Не рекомендуется аэрировать воду в сосудах с дафниями.

Кормом для  дафний служат зеленые водоросли (хлорелла или сценедесмус) и хлебопекарные дрожжи. Культуру зеленых водорослей выращивают на одной из искусственных питательных средах, которые готовят на дистиллированной воде. Навеску каждого вещества растворяют в небольшом количестве воды, а затем растворы сливают вместе в порядке расположения реактивов   (чтобы избежать осадка) и доливают воду до соответствующего объема. Готовят два раствора микроэлементов отдельно (А₃ и В₂) и вносят их по 1 мл на 1 л среды. Среду Тамия перед посевом водорослей разбавляют дистиллированной водой в 3—5 раз.

Посев водорослей производят альгологически чистой культурой, которую выращивают в стерильных условиях. Культуру водорослей вносят в питательную среду в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Исходная концентрация около 2 тыс. кл/мл.

Культивируют водоросли в стеклянных кюветах, батарейных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении лампами дневного света 3000 лк и постоянном продувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7—10 суток, когда окраска культуры водорослей становится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 2—3 сут. Осадок разбавляют в два раза дистиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 сут. Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 мл суспензии (600—1000 млн. кл/мл) на л воды.

1 — 2 раза  в неделю дафний кормят хлебопекарными  дрожжами. Для приготовления дрожжевого  корма 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды.

Раствор дрожжей  хранится в холодильнике до двух суток. Можно кормить дафний сырым рисом. Рис предварительно размачивают в теплой воде (3—4 ч.) и вносят в культуру из расчета 1 — 2 зерна на 1 л воды. Рис держат в культуре до 10 дней при постоянной продувке мелкодисперсными пузырьками воздуха. При хроническом опыте дафний кормят только хлореллой — по 5 капель на 100 мл(13).

При необходимости  биотестирования воды с общим  содержанием солей свыше 3 г/л выращивают культуру, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют дафний и минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. Вначале его вносят из расчета 500 мг/л. Через неделю минерализацию воды повышают еще на 250 мг/л. Эту операцию повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не выше 6 г/л с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно. Эта же среда служит контролем при биотестировании и в качестве разбавляющей. Адаптированных к повышенному содержанию солей дафний нельзя использовать для тестирования вод с более низким содержанием солей.

Чтобы получить исходный материал для биотестировання, берут 30—40 самок дафний с выводковыми камерами полными яиц или зародышей, за 1 — 2 сут. До биотестирования их пересаживают в 0,5 — 1 л емкости (стаканы, кристаллизаторы) с водой для культивирования, в которую перед посадкой дафний вносят корм. После появления молоди (каждая самка может выметать от 10 до 40 молодых дафний) взрослых особей удаляют.

При кратковременном  биотестировании используют только односуточных дафний, а двухсуточных самок — при длительном биотестировании.

Перед началом  биотестирования в пробе воды определяют концентрацию растворенного кислорода, которая должна быть не менее 6,0 мг/л (оптимально 6,0 —7,0). Если она ниже 6,0 мг/л, то перед биотестированием воду аэрируют с помощью микрокомпрессора. В процессе биотестирования аэрировать воду не рекомендуется. Биотестирование проводят при тех же условиях, что и культивировании. Результаты биотестирования считают правильными, если гибель дафний в контроле не превышает 10% в остром опыте и 25% в хроническом и концентрация растворенного в тестируемой воде кислорода в конце биотестирования составляет не менее 2 мг/л.

Для определения наличия острого токсического действия сточной воды на сбросе в водный объект воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности сточной воды, отобранной из разных мест или в разное время, готовят серию разбавлении (не менее трех).

Объем пробы воды для  биотестирования без разбавления — 500 мл, с учетом разбавлении — 1 л.

Посадку дафний в сосуды для биотестирования  проводят следующим способом: стеклянной трубкой диаметром 0,5 — 0,7 см отлавливают  дафний из культуры, помещают в сачок из планктонного газа, погрузив его в тестируемую воду, переводят в нее дафний, посадку ведут от разбавлении тестируемой воды с большей кратностью к меньшей.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд помещают по 10 односуточных дафний и экспонируют при оптимальных условиях в течение времени до 96 ч. При кратковременном биотестировании дафний не кормят.

Учет выживших дафний проводят через 1, 6, 24, 48, 72, 96 ч. Особей считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания. Если в любой считываемый период времени в сточной воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают.

Для определения  наличия хронического токсического действия воды в контрольном и  других створах водного объекта  воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности разных проб воды или использовать результаты биотестирования при установлении величин ПДС, готовят серию разбавлении. Определяют минимальную кратность разбавления, при которой хроническое токсическое действие не проявляется.

Объем пробы воды для  биотестирования без разбавления — 1 л, с учетом разбавлении — 3 — 5 л.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд вносят одинаковое количество корма, помещают по 10 двухсуточных самок дафний и экспонируют при оптимальных условиях. Дафний кормят ежесуточно. Три раза в неделю в сосудах с дафниями производят смену контрольной и тестируемой воды на свежеотобранную. При смене воды дафний кормят за 3 ч до смены. Допускается использовать воду, хранящуюся в холодильнике.

С момента появления  молоди, в те сутки, когда меняют воду, производят учет выживших исходных самок и выметанной молоди. Для этого самок с помощью стеклянной трубки пересаживают в заранее подготовленные сосуды с контрольной и тестируемой водой (соответственно) и подсчитывают их количество в каждом сосуде. Оставшуюся воду процеживают через сито из планктонного газа. При этом на сите остается выметанная молодь, которую подсчитывают и удаляют.

После того, как в контроле все исходные самки дадут по четыре помета, биотестирование заканчивают.  Время биотестирования сокращается, если при промежуточном подсчете устанавливают достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

 При биотестировании  сточной воды на сбросе в  водный объект рассчитывают процент погибших дафний в тестируемой воде по сравнению с контролем

                         А=(N₂/N₁)*100%                                                                                (3.1)

N₁ – среднее арифметическое количество дафний, выживших в контроле;

N₂ – среднее арифметическое количество дафний, выживших в тестируемой воде.

Если А>50%, тестируемая  вода оказывает острое токсическое действие, если А<50%, тестируемая вода не оказывает острого токсического действия на дафний.

Для определения степени  острого токсического действия тестируемой воды рассчитывают графическим методом:

ЛКр₅₀-96 ч — кратность разбавления тестируемой воды, при которой гибнет 50% дафний за 96 ч;

ЛКр₀-96 ч — минимальную кратность разбавления, при которой дафнии не гибнут за 96 ч.

На оси абсцисс откладывают  логарифмы величин кратности  разбавлении тестируемой воды, а на оси ординат — средние арифметические величины выживаемости дафний в процентах к контролю. Полученные точки соединяют прямой. От точек на оси ординат, соответствующих 50 и 100% выживаемости, проводят линии, параллельные оси абсцисс. Из точек пересечения этих линий с экспериментальной прямой опускают перпендикуляры на ось абсцисс и находят логарифмы величин кратности разбавлении, которые будут соответствовать исковым величинам ЛК_р50 и ЛК_ро. Чем больше величины ЛК_р50 и ЛК_ро, тем токсичнее тестируемая вода.

Степень токсичности  можно также установить, рассчитав  ЛК_р50 — среднее время гибели 50% дафний в тестируемой воде. Для этого строят график (на оси абсцисс откладывают время наблюдения, на оси ординат — выживаемость в процентах к контролю). Чем меньше ЛК_р50, тем токсичнее тестируемая вода.

При биотестировании  воды из контрольного или других створов водного объекта вывод о наличии хронического токсического действия делают на основании установления достоверности различия между показателем выживаемости или плодовитости дафний в контроле и в тестируемой воде. Для этого рассчитывают среднее арифметическое показателей выживаемости и плодовитости в контрольной и тестируемой воде

Результаты  биотестирования разбавлении тестируемой  воды с целью их использования  при установлении величин ПДС  или определения степени хронического токсического действия тестируемой воды обрабатывают с помощью вышеописанных приемов. Определяют минимальную кратность разбавления тестируемой воды, при которой различия между величинами показателей выживаемости и плодовитости дафний в контроле и соответствующем разбавлении будут недостоверными.

Если получают две разные величины минимальной  кратности разбавления тестируемой воды (одну, при которой недостоверным будет отличие от контроля показателя выживаемости, и другую, при которой недостоверным окажется отличие от контроля показателя плодовитости), вывод об отсутствии хронического токсического действия на дафний делают на основании большей величины.

Периодически, не реже одного раза в месяц, необходимо проводить контроль чувствительности дафний и цериодафний к «эталонному» токсиканту бихромату калия (K₂Cr₂O₇). Концентрация бихромата калия, которая в течение 24 часов иммобилизует 50% дафний, взятых для эксперимента, должна находиться в диапазоне 0,9—2,0 мг/л. Указанный диапазон концентраций вызывает 50%-ную иммобилизацию дафний и цериодафний. Испытания проводятся в соответствии с общими требованиями для биотестирования. Используется для испытания, бихромат признанного аналитического качества. Если результаты опытов не укладываются в указанный интервал, т» следует проверить правильность приготовления исследуемых растворов, соблюдение условий проведения опытов, правильность выбора возраста рачков. Если ошибки исключены, следует заменить культуру, получив ее в базовых лабораториях по биотестированию.

Биотестирование является дополнительным экспериментальным приемом для проверки необходимости корректировки величин ПДС по интегральному показателю «токсичность воды», который позволяет учесть ряд существенных факторов: наличие в сточной воде токсических веществ, неучтенных при установлении ПДС, вновь образовавшихся соединений, метаболитов, различные виды взаимодействий химических веществ — синергизм, антагонизм, аддитивность и т. д.

Необходимость корректировки величин ПДС возникает  в том случае, если при биотестировании воды из контрольного створа водного объекта установлено несоответствие ее качества требуемому нормативу: вода в контрольном створе водного объекта не должна оказывать хронического токсического действия на тест-объекты (дафний или цериодафний).

При необходимости корректировки величин ПДС применяют методику длительного биотестиоования с использованием дафний или цериодафний. Определяют минимальную кратность разбавления сточной воды на сбросе в водный объект, при которой не проявляется хроническое токсическое действие, и сравнивают ее с расчетной кратностью общего разбавления сточных вод в контрольном створе. В качестве контрольной и разбавляющей используют воду водного объекта, отобранную вне зоны влияния тестируемой сточной воды.

Если расчетная  кратность n общего разбавления сточных вод в контрольном створе меньше, чем необходимая кратность n_т разбавления сточной воды, определенная при биотестировании, и не может быть увеличена за счет изменения конструкции или местоположения выпуска, величину ПДС корректируют в сторону уменьшения.

Результаты  биотестирования устанавливают  токсичность сточных вод вне связи с конкретными веществами. Поэтому, если не известно, какое именно вещество оказало токсическое воздействие, корректировку ПДС производят за счет уменьшения существующего расхода сточных вод q до величины q^max, обеспечивающей выполнение условия:

                                 n≥n_т                                                                                                          

При этом скорректированную величину ПДС по каждому веществу определяют согласно формуле

ПДС’=(q^max/q)*ПДС                                                                                (3.2)

Для выпуска  сточных вод в водоток величина расхода сточных вод существенно влияет только на основное разбавление, определяемое в соответствии с формулой.

При этом максимальный расход сточных вод q^max, удовлетворяющий условию (3.2), определяют из решения уравнения

            1+Р_m                                     n_т

1+P_mexp (-Ь V P_m)              n_н                                                                                                       (3.3)

 

        где Pm=Q/ q^max;  Ь = ц&V³DL/Q, Q — расчетный расход водотока, м³/с; ц — коэффициент извилистости (отношение расстояния от выпуска до контрольного створа по фарватеру к расстоянию по прямой); & — коэффициент, зависящий от места выпуска сточных вод (при выпуске у берега &=1, при выпуске в стрежень реки &=1,5); 1 — расстояние от выпуска до контрольного створа по фарватеру, м; D — коэффициент турбулентной диффузии, определяемый в соответствии с формулами.