Классификация и систематика микроорганизмов

3-й этап - идентификация  выделенных облигатных анаэробов. Проводят биохимическую идентификацию в микротест-системе.

 

26. Рост и размножение бактерий. Фазы развития популяции.

Рост – координированное воспроизведение клеточных компонентов и структур, ведущий в конечном итоге к увеличению массы клетки.

Размножение – увеличение числа клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования.

Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз:

• Лаг- фаза – период между посевом и началом размножения. (4-5 часов). Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению, нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.
• Фаза логарифмического(экспоненциального) роста – период интенсивного деления бактерий. (5-6 часов) Бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, НК и др.
• Фаза стационарного роста- количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальных уровень. (М-концентрация)
• Фаза гибели -  отмирание бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий.

 

27. Бактериологический метод исследования, его этапы.

Бактериологический метод исследования является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильного его выполнения зависит определение этиологического фактора, который вызывал заболевание, и, соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность этого метода объясняется тем, что во многих случаях врачи имеют дело с микробными ассоциациями, тогда необходимо устанавливать роль каждого из микробов в возникновении болезни.

Потому перед освоением основных принципов и методов выделения чистых культур необходимо овладеть техникой посевов и пересеваний бактерий в жидких и на плотные питательные среды.

 

Бактериологическое исследование подразумевает получение чистой культуры возбудителя и установление его принадлежности к виду, роду и т. д. Данный метод включает в себя определенные этапы.

Вначале выделяется чистая культура возбудителя с помощью посева на плотные питательные среды. Выбор питательной среды зависит от свойств предполагаемого возбудителя. На следующем этапе осуществляют исследование полученных колоний бактерий макроскопическим и микроскопическим методами. Затем из небольших фрагментов каждой из образовавшихся колоний готовят мазки, которые окрашивают по Грамму. Далее исследуют их под микроскопом, определяя свойства, присущие выделенной культуре, и проверяют ее чистоту. 
Оставшуюся часть колонии переносят в специальные пробирки со скошенным агаром (плотной питательной средой) для накопления чистой культуры с целью последующего полного изучения данной колонии. Все пробирки с агаром ставят на 18—24 ч в термостат. На 2-м этапе бактериологического исследования зачастую учитывают количество образовавшихся колоний микроорганизмов. Это имеет огромное значение при наличии у пациента заболеваний, вызываемых условно-патогенной микрофлорой. На З-м этапе бактериологического исследования проводятся идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и установление степени его чувствительности к антибиотикам и прочим химиотерапевтическим лекарственным препаратам. Идентификацию культуры осуществляют по морфологическим, биохимическим, тинкториальным, антигенным, культуральным и токсикогенным свойствам:

 

28. Ферменты бактерий, их классификация. Значение ферментов в идентификации бактерий.

Ферменты распознают соответствующие метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Являются белками, участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), то есть метаболизма. 

По локализации:

• Экзоферменты – выделяются во внешнюю среду и действуют на субстрат вне клетки (протеазы)
• Эндоферменты – действуют на субстрат внутри клетки (ферменты, расщепляющие аминокислоты, моносахара)

Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. Конститутивные ферменты синтезируются клеткой непрерывно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются только при наличии в среде субстрата данного фермента. Например, кишечная палочка на среде с глюкозой практически не образует Р-галактозидазу, но резко увеличивает ее синтез при выращивании на среде с лактозой или другим Р-галактозидом.

Известно более 2000 ферментов. Они объединены в шесть классов: оксидоредуктазы окислительно-восстановительные ферменты (к ним относятся дегидрогеназы, оксидазы и др.); трансферазы, переносящие отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим; гидролазы, ускоряющие реакции гидролиза, то есть расщепления веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы и др.); лиазы, отщепляющие от субстратов химические группы негидролитическим путем (карбоксилазы и др.); изомеразы, превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза и др.); лигазы, или синтетазы, ускоряющие синтез сложных соединений из более простых (аспарагинсинтетаза, глютаминсинтетаза и др.). 
Различия в ферментном составе используются для идентификации микроорганизмов, так как они определяют их различные биохимические свойства: сахаролитические (расщепление сахаров), протеолитические (разложение белков) и другие, выявляемые по конечным продуктам расщепления (образование щелочей, кислот, сероводорода, аммиака и др.).

29. Сахаролитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью ферментов разлагать сахара до более простых соединений – кислоты, газа, альдегидов. Эти вещества можно обнаружить в питательной среде с помощью специальных химических веществ – индикаторов. Для определения сахаролитических ферментов исследуемую культуру засевают на среды Гисса. «Пёстрый ряд» Гисса (короткая схема) содержит 5 пробирок с жидкими средами: к пептонной воде добавляют последовательно глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу и сахарозу и индикатор Андреде в каждую пробирку. Цвет сред до посева – жёлтый. Исследуемую культуру засевают в среды Гисса и культивируют при 37°   18 – 24 часа. Под действием сахаролитических ферментов бактерий  углеводы расщепляются с образованием кислоты и газа. Наличие кислоты определяют по покраснению среды – в кислой среде индикатор Андреде меняет цвет с жёлтого  на  ярко - розовый. Выделение газа можно определить визуально по образованию пузырьков или более точно – с помощью поплавков, погружённых в среду перед посевом. При отсутствии у бактерий сахаролитических ферментов к данному углеводу рост  бактерий выражается в помутнении среды без изменения цвета. Наличие кислоты в среде в схеме бактериологического исследования обозначается «К», наличие газа – «Г».

 

30.Протеолитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью протеолитических ферментов расщеплять молекулы белка до аминокислот и простых веществ – сероводорода, индола и др.

      Для обнаружения  протеолитических ферментов исследуемую  культуру засевают на мясо – пептонный бульон или пептонную воду. Под пробки пробирок вводят индикаторные бумажки, пропитанные реактивными растворами.

       Если  бактерии разлагают белок с  образованием сероводорода, то реактивная  бумажка  окрашивается в чёрный  цвет. Некоторые бактерии разлагают  белок с накоплением в окружающей  среде индола. В этом случае  индикаторная бумажка окрашивается  в малиновый цвет. Присутствие  продуктов распада белка в  пробирке -  сероводорода и индола -  свидетельствует о протеолитической  активности бактерий и обозначается  на схеме  H2S (+)  и индол (+) соответственно.

III. Протеалитическую активность бактерий можно изучать на желатиновой среде. При посеве на желатин бактерии с сильной протеолитической активностью разжижают его. Форма разжижения желатина характерна для некоторых видов бактерий и используется как видовой признак в лабораторной диагностике инфекций.

 

31. Белковый обмен у бактерий:

- процесс синтеза собственных  аминокислот и белков путем  асси­миляции необходимых компонентов из внешней среды;

- внеклеточное расщепление  белков под воздействием различных  ферментов.

Если расщепление белков происходит в анаэробных условиях, то процесс называется гниением.

Если в аэробных условиях — тлением.

При наличии у бактерий протеаз белки расщепляются ими до промежуточных продуктов распада — пептонов. При наличии пептидаз пептоны расщепляются ими до амино­кислот и продуктов их распада (аммиака, сероводорода, индола). Протеолитические (способность расщеплять белки) и пептоли-тические (способность расщеплять пептоны) свойства выражены далеко не у всех бактерий, поэтому их изучение в совокупно­сти с другими ферментативными свойствами помогает иден­тифицировать бактерии.

Ионный обмен: Для роста и размножения бактерий необходимы неорганические ионы. Одни из них, например ионы аммония, могут использоваться бактериями в качестве единственного источника азота. Ионы К+ бактерии используют для биосинтеза белка, поскольку они необходимы для связывания тРНК с рибосомами, образования комплекса иРНК с рибосомами и поддержания функциональной активности рибосом и структуры полисом. Поступление ионов К+ в бактерии, например в клетки Е. coli, зави¬сит от функционирования специфических транспортных белков. Одни из этих белков осуществляют непосредственное проникновение в клетку, а другие способствуют внутриклеточному удержанию этих ионов. Благодаря высокой внутриклеточной концентрации ионов К+ бактерии поддерживают высокое внутриклеточное давление. Потребность бактерий в ионах Mg2+ определяется их способностью быть кофактором многих ферментов. Ионы магния важны для стабилизации ряда ферментативных ансамблей, например РНК-поли- меразы, а также рибосом. Железо выполняет в бактериях роль кофа¬ктора для ряда ферментативных процессов, входит в состав цитохромов и других гемопротеидов.

 

32.В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения.

В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:

1) спиртовое (характерно для грибов);

2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий);

3) молочнокислое (характерно для стрептококков);

4) маслянокислое (характерно для сарцин);

5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл).

Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.). Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями.

Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз.

Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.

Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов.

Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.

Углеводный обмен у бактерий также носит двоякий характер — это процесс синтеза и распада углеводов.

Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойст­ва) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэроб­ных условиях — брожением.

В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различаютброжение:

•  спиртовое;•  молочнокислое;•  пропионовокислое;•  муравьинокислое;•  маслянокислое;

•  уксуснокислое.

Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий,  осуществляющих брожение,  —  облигатные анаэробы. Однако некоторые из них — факультативные анаэробы — способны осуществлять процесс брожения в при­сутствии кислорода, но без его участия. Более того, кислород подавляет процесс брожения, и оно сменяется горением (дыха­нием — конечный акцептор водорода — кислород). Этот эффект был назван эффектом Пастера и является одним из классических примеров смены метаболизма у бактерий в за­висимости от условий среды.

 

33.Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм. В среднем они в 50 раз меньше бактерий. Их нельзя увидеть в световой микроскоп, так как их длины меньше длины световой волны.

Вирусы состоят яз различных компонентов:

а) сердцевина - генетический материал (ДНК или РНК). Генетический аппарат вируса несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу и другие.

б) белковая оболочка, которую называют каспидом.

Оболочка часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии.

в) дополнительная липопротеидная оболочка.

Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина. Она встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес).

Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом.

Классификация

а) Вирусы классифицируются по сердцевине: ДНК-содержащие и РНК-содержащие (ретро) вирусы.

б) По структуре капсомеров.

Изометрические (кубические), спиральные, смешанные.

в) По наличию или отсутствию дополнительной липопротеидной оболочки

г) По клеткам-хозяинам

Кроме этих классификаций есть еще много других. На пример, по типу переноса инфекции от одного организма к другому.

Вирусы обладают следующими свойствами. 1. Это мельчайшие живые организмы. 2. Они не имеют клеточного строения. 3. Вирусы способны воспроизводиться, лишь проникнув в живую клетку. Следовательно, все они — облигатные эндопаразиты. Иными словами, вирусы могут жить, лишь паразитируя внутри других клеток. Большинство из них вызывает болезни. 4. Вирусы устроены очень просто. Они состоят из небольшой молекулы нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, окруженной белковой или липопротеиновой оболочкой. 5. Они находятся на границе живого и неживого. 6. Каждый тип вируса способен распознавать и инфицировать лишь определенные типы клеток. Иными словами, вирусы высокоспецифичны в отношении своих хозяев.