Изучение интенсивности углеводного обмена в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae в зависимости от типа углевода

    

  Ход брожения может сильно меняться в зависимости  от условий. Например, при добавлении в среду бисульфита, блокируется образование этанола, потому что, образующийся из пирувата ацетатальдегид  связывается с бисульфитом, и образует бисульфитный аддукт. Для окисления НАД*Н дрожжевые клетки используют половину образующегося триозофосфата. Последний, восстанавливаясь, превращается в глицерин. Хотя при этом суммарный выход АТФ становится равным нулю, а, следовательно, такое брожение не может обеспечить рост клеток.

  Все бродящие дрожжи способны сбраживать глюкозу  и фруктозу, причина этого в  том, что именно с этих сахаров  начинается гликолитическое расщепление. В основном дрожжи способны сбраживать гексозы и олигосахариды, включающие остатки гексоз. Из моносахаридов, наиболее часто сбраживается галактоза, из дисахаридов – сахароза, мальтоза, трегалоза.

  Некоторые дрожжи способны сбраживать полисахариды, состоящие из гексозных остатков. Например, Saccharomycopsis fibuliger  могут сбраживать крахмал.

  Дрожжей, способных сбраживать пентозы, очень  мало,до 80-ых годов прошлого века, они  не были известны (например, Pichia stipitis ), но вот окислять пентозы кислородом воздуха могут многие виды дрожжей. 

  Углеводы.

  Классификация углеводов.

  Углеводы можно определить как альдегидные(карбонильная группа СОН) или кетонные (нарбонильная группа СО) производные полиатомных (содержащих более одной ОН-группы) спиртов или как соединения, при гидролизе которых образуются эти производные.

  Согласно  принятой в настоящее время классификации, углеводы подразделяются на три основные группы: моносахариды, олигосахариды  и полисахариды.

  

  Моносахариды можно рассматривать как производные многоатомных спиртов, содержащие карбонильную (альдегидную или кетонную) группу. Если карбонильная группа находится в конце цепи, то моносахарид представляет собой альдегид и называется альдозой; при любом другом положении этой группы моносахарид является кетоном и называется кетозой.

  Так же, это  углеводы, которые не гидролизуются. В свою очередь, в зависимости  от числа атомов углерода моносахариды подразделяются на триозы, тетрозы, пентозы и проч.

    Олигосахариды - углеводы, гидролизующиеся с образованием двух (дисахариды) или нескольких молекул моносахаридов. Например,

  С12Н22О11      +     Н2О =    2С6Н1206

  Дисахарид                      гексоза

  Полисахариды - углеводы, гидролизующиеся с образованием множества молекул моносахаридов, чаще всего глюкозы.

 

Задачи:

1. проанализировать доступную литературу по данному вопросу.
2. в одни и те же образцы питательной среды с дрожжами, содержащей минимум углеводов, например, желатин, добавить различные углеводы в одной и той же молярной концентрации.
3. произвести брожение
1. в отсутствии кислорода воздуха (с гидрозатвором)
2.   в аэробной среде
4. через равные промежутки времени зафиксировать уменьшение массы образцов за счет выделения СО2.
5. повторить несколько раз эксперимент.
6. проиллюстрировать в виде графиков.
7. проанализировать результаты.

 

Цель:

   Исследовать усвояемость различных углеводов, а также их производных в клетках дрожжей Saccharomyces С. в анаэробных условиях.  

Методы: 

1. Анализ  литературы.
2. Экспериментальное наблюдение за углеводным метаболизмом, а так же количественная оценка его продуктов.
3. Анализ полученных результатов.

 

Гипотезы:

  1.При брожении  дрожжи селективно усваивают углеводные субстраты.

  2. Такие  моносахариды как пентоацетилглюкоза,  галактоза и арабиноза, а так же трисахарид рафиноза не будут усваиваться дрожжами.

  3.Дрожжи  смогут осуществлять брожение на глюкозе, мальтозе и сахарозе.

  4. D-Сорбит, являющийся сахароспиртом, так же не сможет послужить субстратом для дрожжевого брожения.  
 

Ход работы.

  Было поставлено 2 эксперимента по следующей методике:

1. В аппарат Киппа поместить  50-60 г карбоната кальция, залить разведенной соляной кислотой, которую приготовить из 100 мл. конц. продажной соляной кислоты и необохдимого количество воды.
2. Подготовить 8 колб объемом 500 мл каждая, ополоснуть их кипятком.
3. Приготовить ацетатный буфер.
4. Разлить в колбы по 200 мл. питательной среды, приготовленной из желатина (10 г желатина поместить в небольшой объем воды, оставить на некоторое время, затем довести до на 1 л, нагреть до кипения, охладить до 50С).
5. Разлить в колбы по 50 мл буферного раствора. Померить рН среды.
6. Когда температура в колбах достигнет 30-35С поместить в каждую колбу по 3 г сухих дрожжей, хорошо встряхнуть и оставить на полчаса.
7. В колбы поместить углеводы, указанные в таблице, заполнить углекислым газом из аппарата Киппа , закрыть временно глухими пробками, осторожно круговыми движениями перемешать содержимое, промаркировать колбы и взвесить.
8. Удалив глухую пробку (пробки сложить так, чтобы в дальнейшем не перепутать!) к каждой колбе присоединить установку, создающую гидрозатвор.
9. Через два часа, газоотводные пробки сменить глухими, колбы осторожно круговыми движениями встряхнуть, для лучшего отделения газ и взвесить. Определить уменьшение массы.
10. Повторять взвешивания через некоторые промежутки времени да прекращения брожения.

 
 
 
 
 
 

Полученные  результаты и их обсуждение.

  В результате проведенных опытов у нас получилось зафиксировать резную интенсивность процессов брожения дрожжей. Соответственно, разной интенсивности выделения углекислого газа, а так же была зафиксирована степень изменения массы образцов за счет процессов брожения, происходящих в образце.

  На основе данного графика можно утверждать, что сахар, вызывающий наиболее активное брожение – мальтоза, что неудивительно, потому что как известно, мальтоза- солодовый сахар, наиболее подходящий данному виду дрожжей.

  Субстрат не вызывающий брожение- D-cорбит, это можно объяснить тем, это сахароспирт, и его окисление энергетически невыгодно. 

   опыт  1 

  Известно,  что сахара подразделяются на группы в зависимости от структуры и  размера,  но в рамках одной группы эффективность процесса сильно различалась (например, D-глюкоза и галактоза). Это происходит из-за того, что у данного вида дрожжей нет ферментов, нужных для ассимиляции данных сахаров.

  Наглядно  протекание процесса брожения иллюстрирует график выделения СО2 

     

  Выводы:

   1. Дрожжи селективно усваивают углеводные субстраты, потому что у каждого вида дрожжей свой ферментативный набор, который не подходит для ассимиляции все типов углеводов.

   2. Пентоацетилглюкоза,  галактоза и арабиноза, а так же трисахарид рафиноза не смогли служить субстратом для брожение, что можно объяснить тем, что это энергетически невыгодно.

  3Дрожжи смогли бродить на глюкозе и сахарозе, это связано с тем, что, сахароза дисахарид ,состоящий из глюкозы и фруктозы, глюкоза же хорошо усваивается дрожжами, потому что с неё начинается гликолитическое расщепление.

  4.мальтоза хорошо ассимилируется дрожжами, потому что  у этих ферментативный набор этих дрожжей полностью подходит для мальтозы, например, у них есть фермент, гидролизующий мальтозу в глюкозу.

  4. . D-Сорбит, являющийся сахароспиртом, так же не смог послужить субстратом для дрожжевого брожения. Это связано с тем, что процесс сбраживания D-сорбита невыгоден энергетически, даже в аэробной среде он протекал не очень активно.

 

Список  использованной литературы:

1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. М: Товарищество научных изданий КМК, 2005, 221 с.

2. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М:  Изд-во Моск.ун-та, 1987.

3.Николаев  Л.А. Химия жизни. Пособие для  учителей, Изд.2-е, перераб. М: Просвещение, 1977

4. Вилли К., Детье В. Биология. Биологические процессы и законы. М: Мир 1975

5. Берри Д.Биология  дрожжей М.: Мир, 1985

6.http: //www.elsevier.com/locate/femsyr  

Приложения:

  Приложение1.

  Графики изменения масс образцов.

    опыт  1

   опыт2

  Графика выдыеления углекислого газа.

   опыт 1

  опыт 2

Приложение 2

Методика приготовления  ацетатного буфера.

1. Аппаратура, материалы  и реактивы — по разд. 1:2.  
2. Готовят 0.2 М раствор уксусной кислоты. Для этого 4,8 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 400 см3 дистиллированной воды.  
3. Готовят 0.2 М раствор уксуснокислого натрия. Для этого .21,76 г уксуснокислого натрия растворяют в 800 см³ дистиллированной воды.  
4. Растворы, приготовленные по пп. 2 и 3, соединяют в соотношении 3 : 7. Для этого 300 см³ раствора уксусной кислоты прилипают к 700 см³ раствора уксуснокислого натрия.  
5. Ацетатный буфер должен иметь рН 5±0,05. Для корректировки значения рН используют избыточные объемы растворов.