Технология получения трансгенных животных

Технология получения трансгенных животных

Включение чужеродных последовательностей ДНК или трансгенов в геном макроорганизма — реципиента с последующей устойчивой их наследуемостью в ряду поколений обеспечивает получение так называемых трансгенных животных. Следовательно, процесс трансгенеза по своему механизму относится к генетической инженерии и, в частности, к генной и клеточной инженерии.

Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в геном животного можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгеноза:

• - метод микроинъекции,
• - опосредованный ретровирусами перенос генов,
• - использование модифицированньгх эмбриональных стволовых клеток,
• - перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток,

 

Микроинъекция ДНК

 

• Микроинъекции рекомбинантной ДНК в оплодотворенные ооциты многоклеточных животных пока остаются наиболее популярным способом введения чужих генов в организм животных. Первой и наиболее хорошо разработанной экспериментальной системой для получения трансгенных животных явилась мышь. Донорных самок мышей с экспериментальной суперовуляцией скрещивают с самцами-производителями, через 12 ч выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культуру. Далее в больший их двух пронуклеусов (обычно мужской) инъецируют рекомбинантную ДНК (рис. 1). Пережившие инъекцию яйцеклетки пересаживают самкам-реципиентам. Только часть трансплантированных ооцитов продолжает развиваться до рождения детенышей.
• На частоту интеграции экзогенной ДНК при использовании метода микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как чистота вводимого образца, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический).
• Трансгенных животных в потомстве идентифицируют различными методами, чаще всего ПЦР, и скрещивают для получения трансгенных линий. Некоторые из трансгенных животных оказываются мозаичными (половые клетки не содержат экзогенной ДНК), поэтому при скрещивании трансгенным оказывается меньшая часть потомства первого поколения, чем расчетные 50 %. В ряде случаев гомозиготные линии получить не удается, поскольку 5-15 % трансгенных инсерций в гомозиготном состоянии летальны, так как инсерция иногда нарушает жизненно-важные части генома.

Рис. 1. Микроинъекция экзогенной ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки млекопитающих под микроскопом (а) и схема  
эксперимента (б)  

Опосредованный ретровирусами перенос генов

 

• Ретровирусные векторы также используются для получения трансгенных животных. Инфицирование предимплантационных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами - относительно несложная эффективная процедура.
• Восьмиклеточную морулу (рис. 2) освобождают от яйцевой оболочки и помещают в культуральную чашку с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус. Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластулы, имплантируют псевдобеременным самкам. В результате формируются трансгенные организмы, мозаичные по числу и локализации встроек рекомбинантной ДНК в геном. Поэтому для получения чистых линий далее необходим масштабный аутбридинг.
• Недостатком метода является ограничение вставки экзогенной ДНК ~8 тнп, вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии, а в некоторых случаях интеграция в исходный локус нестабильна.
• Новые лентивирусные векторы (лентивирусы принадлежат семейству ретровирусов) показали свою очень высокую эффективность при доставке ДНК в ооциты и зиготы. Инъекция рекомбинантных лентивирусных конструкций в перивителлиновое пространство свиных зигот и коровьих ооцитов привело к появлению потомства с самой высокой на данный момент долей трансгенных особей. В то же время лентивирусные векторы обладают всеми недостатками ретровирусных: малый размер вставки экзогенной ДНК и множественная интеграция в хозяйский геном, которая может привести к таким нежелательным побочными эффектам, как активация онкогенов и инсерционный мутагенез. Кроме того, для лентивирусных векторов наблюдается высокая степень мозаичности получаемого трансгенного потомства и отдельные факты сайленсинга (инактивации) лентивирусных рекомбинантных последовательностей в полученных трансгенных линиях.

 

Рис. 2. Схема получения линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов  

Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток.

 

• Модифицированные эмбриональные стволовые клетки могут быть использованы для получения трансгенных животных. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты (рис. 3).
• Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). В ES-клетки в культуре можно ввести целевой трансген различными методами (трансфекция, электропорация, ретровирусная инфекция и т.д.) без нарушения их плюрипотентности. Практическое достоинство этой схемы заключается в том, что она дает большие возможности для проведения селекции клеток по определенному параметру. Это может быть число копий трансгена, его локализация или характер экспрессии.
• Отобранные трансгенные ES-клетки можно культивировать и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания трансгена, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем.
• Все получаемые по такой схеме животные являются мозаиками, поэтому необходима селекционная работа по получению чистых линий. Проблему мозаичности первичных трансгенных животных можно преодолеть пересадкой ядер трансформированных ES-клеток в энуклеированные ооциты, которые затем продолжают свое нормальное развитие. В результате в каждой клетке полученного животного будет содержаться трансген.
• К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные мышиным, пока не обнаружены у других млекопитающих и птиц, но поиски продолжаются.

Рис. 3. Получение трансгенных мышей методом реконструкции эмбрионов с помощью генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток (ES-клеток). ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши

Перенос ядер трансформированных генеративных и соматических клеток.

 

• Перенос ядер трансформированных генеративных и соматических клеток в яйцеклетку, или соматический ядерный перенос (somatic nuclear transfer), еще один способ, используемый в практике трансгеноза. Было показано, что ядра эмбриональных клеток различных животных при переносе в энуклеированную яйцеклетку иногда способны обеспечивать развитие целого нового организма. После непродолжительного культивирования даже ядра из некоторых дифференцированных клеток способны обеспечивать развитие до жизнеспособной особи.
• Так, например, знаменитая овечка Долли была клонирована в 1997 г. слиянием культивируемых (3-6 пассажей) клеток эпителия молочной железы (вымени) взрослого шестилетнего животного с лишенной ядра яйцеклеткой (рис. 4). Хотя нельзя исключить, что для клонирования случайно была взята недифференцированная клетка, присутствующая в донорском эпителии.
• Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. В зиготах овец в течение первых трех делений, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.
• Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание любых трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, - это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре.

Рис. 4. Клонирование овцы методом переноса ядра. Эпителиальные клетки молочной железы в культуре индуцируют для перехода в фазу G0 (стадия, на которой находится яйцеклетка). Затем осуществляют слияние такой клетки с энуклеированной яйцеклеткой и выращивают эмбрионы до ранних стадий эмбриогенеза. После чего эмбрионы имплантируют в матку суррогатной матери, где происходит дальнейшее развитие. В эксперименте Я. Уилмута (I. Wilmut) по клонированию Долли было проведено 277 слияний безъядерных яйцеклеток с клетками молочной железы в фазе G0, из 29 выживших эмбрионов только один развился до жизнеспособного организма  

Заключение

 

• Развитие биотехнологии сельскохозяйственных животных, в том числе генная инженерия, открывает новые возможности развития животноводства. Уже имеющиеся результаты по получению трансгенных животных говорят о возможности изменения ряда важнейших хозяйственно-ценных признаков.
• Другим важнейшим направлением генной инженерии является получение трансгенных особей с интегрированными в геном генными конструкциями, связанными с усилением иммунитета животных к инфекционным заболеваниям.
• Третьим актуальным направлением генной инженерии животныж является получение животных продуцентов биологически активных веществ, необходимых в медицине, ветеринарии и технологии переработки продуктов животноводства. Многие биологически активные вещества не могут производиться традиционными методами в достаточных количествах и с желательным качеством.
• В заключение хотелось бы подчеркнуть, что, разработка теории трансгенеза сельскохозяйственных животных и поиски путей практического использования этого метода идут параллельно, в связи с чем получение как положительных так и отрицательных результатов вполне возможно
• Таким образом, успехи в области молекулярной генетики и биологии гена должны обеспечить дальнейший прогресс в проблеме трансгенеза сельскохозяйственных животных, а, следовательно, в повышении эффективности и рентабельности производства многообразной животноводческой продукции.