Использование достижений биотехнологии в фармацевтике

1.Использование достижений биотехнологии в фармацевтике

Биотехнология - это производственное использование биологических агентов  или их систем для получения ценных продуктов и осуществления процессов  различного назначения. В целом, биотехнология  представляет собой систему приемов, позволяющих получать промышленным способом ценные продукты за счет использования  процессов жизнедеятельности живых  организмов.                                                                                                                         В фармацевтической промышленности биотехнологии применяются для производства антибиотиков, иммунобиологических препаратов, генно-инженерных лечебно-профилактических препаратов, для производства энзимов, биологически активных веществ и других медицинских препаратов. Важным направлением биотехнологий в медицине является использование биотехнологий для реконструкции тканей и органов человека с использованием стволовых клеток.                                                                                            Одним из перспективных направлений является использование нанотехнологий в медицинских целях, создание новых носителей и средств целевой доставки лекарственных препаратов.                                                                     Новые биологические технологии используются в диагностике и лечении сердечно-сосудистых, онкологических, аллергических и эндокринных заболеваниях.                                                                                                                    Ежегодный прирост мирового рынка биотехнологической продукции составляет 7-10%. Уже сегодня использование биотехнологических разработок позволяет решать многие проблемы диагностики и лечения особо опасных заболеваний, недостаточного или несбалансированного питания, повышения качества питьевой воды.                                                                          В современных условиях нередко наблюдается тесное переплетение биотехнологии и биоорганической химии. Так, при получении многих лекарственных веществ используются перемежающиеся этапы био- и органического синтеза с последующей трансформацией целевых продуктов, осуществляемой биологическим или химическим методом. При обсуждении перспектив биотехнологии и ее стратегических целей все чаще подчеркивается ее связь с молекулярной биологией и молекулярной генетикой. Широкое распространение получило понятие молекулярной биотехнологии как научной дисциплины, уже в основном сформировавшейся на стыке технологии рекомбинантной ДНК (генетическая или генная инженерия) и традиционных биологических дисциплин, в первую очередь микробиологии, что объясняется техническими причинами более легкого оперирования микробными клетками. Ведется конструирование новых продуцентов биологически активных веществ с помощью технологии рекомбинантной ДНК. В настоящее время бурно развивается и такая область молекулярной генетики как геномика, основная цель которой - полное познание генома, т.е. совокупности всех генов любой клетки, включая клетки человека. Путем секвенирования установления полной последовательности нуклеотидов в каждом без исключения гене создается своеобразное «досье», отражающее не только видовые, но и индивидуальные особенности организма.                                                                                             Сегодня человечество совершенно справедливо полагает, что биотехнологические науки занимают приоритет в области современных высоких технологий. Сиквенирование геномов и валидация новых мишеней для действия лекарственных соединений является одним из перспективных направлений современной фармакологии. Учитывая, что появились новые принципиальные возможности для сиквенирования, встает вопрос о генетической паспортизации населения, когда каждому будет выдан его генетический паспорт, и человек будет решать проблемы своего здоровья. Важнейшим достижением прошлого века являются стволовые клетки, что стало возможным благодаря развитию всей эмбриологии и цитологии. Это позволило подойти к разработке путей создания искусственных органов, получать новые вещества, специфически влияющие на органы-мишени.             На современном этапе развития биотехнологии большое внимание уделяется разработке подходов к созданию новых процессов в медицинской биотехнологии. Это различные методы модификации микроорганизмов, растений и животных, в т.ч. культивирование растительных клеток как источника получения новых веществ; конструирование молекул, нанотехнологии, компьютерное моделирование, биокаталитическая трансформация веществ и т.д.                                                                                              Таким образом, в получении лекарственных препаратов, производимых биотехнологическим способом, можно выделить как бы два пула — новые соединения, получаемые с помощью биотехнологических процессов, комбинаторной химии, и новые мишени, которые идентифицируются в процессе изучения геномов. Это дает возможность отбирать молекулы, обладающие новыми биологическими и физиологическими свойствами, которые и будут выполнять роль лекарств.

Прежде всего, обратимся к медицинской  ветви биотехнологии. Рассматривая различные классы соединений, используемые в клинической практике, и получаемые методами биотехнологии, в первую очередь, необходимо назвать антибиотики - самый  большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые агенты, противоопухолевые лекарства  и алкалоиды. Производство антибиотиков исчисляется тысячами тонн. Пенициллины, как известно, были выделены при  выращивании грибов рода Penicillium. В 1945 г. из пробы морской воды была выделена плесень Cephalosporium acremonium, синтезирующую  несколько антибиотиков; один из них, цефалоспорин С, оказался особенно эффективен против устойчивых к пенициллину  грамположительных бактерий.                                                                                  Из нескольких тысяч открытых антибиотиков львиная доля принадлежит актиномицетам. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, один только вид Streptomyces griseus синтезирует более пятидесяти антибиотиков. Начиная с середины 1960-х гг. в связи с возросшей сложностью выделения эффективных антибиотиков и распространением устойчивости к наиболее широко применяемым соединениям у большого числа патогенных бактерий исследователи перешли от поиска новых антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Они стремились повысить эффективность антибиотиков, найти защиту от инактивации ферментами устойчивых бактерий и улучшить фармакологические свойства препаратов. Антибиотики вырабатываются в результате совместного действия продуктов 10—30 генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые могли бы повысить выход антибиотика с нескольких миллиграммов на литр в штамме дикого типа до 20 г/л и более. Такие высокопродуктивные штаммы Penicillium chrysogenum или Streptomyces auerofaclens (продуценты пенициллина или тетрациклина) были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции. Определенные мутанты, так называемые идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой ее половиной. Такая форма мутационного биосинтеза привела к открытию новых производных антибиотиков.                     Число противоопухолевых веществ микробного происхождения довольно ограниченно. Блеомицин, выделенный из культур Streptomyces verticilliis, представляет собой гликопептид, который действует, разрывая ДНК опухолевых клеток и нарушая репликацию ДНК и РНК. Другая группа противоопухолевых агентов создана на основе комбинации аминогликозидной единицы и молекулы антрациклина. Недостатком обоих соединений является их потенциальная опасность для сердца.                  Антибиотики используются грибами и актиномицетами в конкурентной борьбе в естественной среде обитания. Человек применил эти соединения для терапии инфекционных и онкологических заболеваний. Это явилось своеобразным толчком эволюционных преобразований в микробной среде, стали возникать устойчивые штаммы бактерий. В связи с этим вновь возникла проблема создания нового поколения более эффективных антибиотиков. В настоящее время протокол лечения инфекционной и хирургической патологии обязательно включает антибиотики. Но, имея неоспоримые преимущества, антибиотики оказывают на организм человека и негативное влияние: нарушается микрофлора желудочно-кишечного тракта, возможны осложнения в функционировании почек и печени, подавляется работа иммунной системы. Поэтому современные схемы лечения являются комплексными и направлены на поддержание адаптационных возможностей человека.                                                                    Новым направлением является использование ферментных препаратов типа «контейнер», изготовление которых стало возможным появлению и совершенствованию методов иммобилизации веществ. Эти препараты представляют собой микросферы с более или менее твердой и проницаемой оболочкой. Назначение этих лекарственных препаратов различное.            Первым типом «искусственных клеток» следует назвать микрокапсулы. Фермент, находящийся внутри оболочки, не контактирует с жидкостями и тканями организма, не разрушается протеиназами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа организма. Основное достоинство микрокапсул заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место, например в непосредственной близости от опухоли. При этом микрокапсула с соответствующим содержанием будет перерабатывать метаболиты, необходимые для роста опухолевой ткани, и эта ткань не будет развиваться. Капсулы могут содержать микроскопические участки тканей. Известно, что терапии диабетических заболеваний уделяется много внимания. Имплантация лекарственного начала избавила бы пациентов от ежедневных инъекций инсулина.                                                                                                            Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды и, следовательно, являться причиной образования тромбов. Однако эффективность микрокапсул при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате «искусственная почка» несомненна. При этом объем аппаратов и, соответственно, количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается.                                                                               В ряде случаев используются высокомолекулярные соединения, растворимые в определенных условиях и сохраняющие высокую прочность оболочек в других. Так ведет себя ацетилфталилцеллюлоза, микрокапсулы, из которой интактны в желудочном соке и растворяются в кишечнике, освобождая содержимое. Сейчас интенсивно исследуются свойства микрокапсул, стенка которых состоит из оболочек эритроцитов. Содержимое эритроцитов удаляется, а «тень» заполняется ферментом. Серьезные успехи достигнуты при лечении аспарагин-зависимых опухолей препаратами аспарагиназы в оболочках эритроцитов. Используются оболочки и других клеток. Так, описаны лекарственные препараты, включенные в оболочки макрофагов. Последние имеют тенденцию накапливаться в очагах воспалений, а следовательно, могут транспортировать туда как низко -, так и высокомолекулярный лекарственный препарат. Существенной положительной стороной «теней» клеток в качестве носителя является их полная совместимость с организмом пациента, поскольку этот носитель готовят на основе клеток, выделенных из крови пациента, и возвращают их ему же с новым содержимым.                                                                        Направленная модификация с помощью методов генной инженерии открывает возможности трансформации структуры ферментов таким образом, что они приобретают качественно новые свойства. Так, особый интерес в мире сейчас представляет возможность перехода от пенициллинов к цефалоспоринам с помощью генно-инженерного фермента экспандазы, благодаря чему унифицируется биотехнологическая часть получения антибиотиков. Далее с помощью других биокаталитических процессов и совмещения их с химическими можно производить класс новых антибиотиков для борьбы с инфекциями.                                         Биокаталитические подходы открывают большое поле для различных вариантов построения новых фармацевтических процессов. В частности, использование генно-инженерных ферментов позволяет получить оптически активные изомеры соединений, которые составляют более 70% всех лекарств. При этом период окупаемости биокаталитических процессов значительно короче по сравнению с химическим синтезом, а по энергозатратам и капиталовложениям они тоже имеют большие перспективы. 

2. современные биотехнологические  способы получения витаминов и липидов

Микроорганизмы содержат много  витаминов, которые чаще всего входят в состав ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят  от биологических свойств данной культуры микроорганизмов и условий  культивирования. Некоторые витамины микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из окружающей среды. Культура, способная синтезировать  какой-либо витамин, называется автотрофной  по отношению к нему, если культура не способна синтезировать данный витамин, она является авто-гетеротрофной.           Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако эргостерин, рибофлавин (В₂), витамин В₁₂ и аскорбиновую кислоту (микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу при производстве витамина С) получают микробиологическим путем. Для синтеза витаминов В₁, В₂, В₆, В₁₂ и аскорбиновой  кислоты также используют кефирные грибки, а бифидобактерии – группы В, РР (никотиновая кислота) и Н, однако пока эти микроорганизмы не используются как продуценты витаминов в промышленных масштабах.                                                                                                 Изменяя условия среды, содержание отдельных витаминов можно увеличить. Так, количество рибофлавина зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде. Количество витаминов в клетках, а также их выделение из последних можно изменить при помощи микроэлементов. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes. Микроводоросль Dunalieiia viridis культивируется с целью получения β-каротина.                          Микроорганизмы являются источником получения липидов специального назначения с заранее определенными свойствами. Микробные жиры заменяют растительные (а в ряде случаев и превосходят) и могут использоваться в разных отраслях промышленности, с.-х., медицине.                  Под липидами подразумеваются все растворимые в неполярных растворителях клеточные компоненты микроорганизмов. В настоящее время ведутся поиски новых источников получения жиров, в том числе и на технические нужды. Этим источником могут стать микроорганизмы, липиды которых после соответствующей обработки пригодны для использования в различных отраслях промышленности: медицинской, химико-фармацевтической, лакокрасочной, шинной и других, что позволит высвободить значительные количества масел животного и растительного происхождения.                                                                                              Технологический процесс получения микробных липидов, в отличие от получения белковых веществ, обязательно включает стадию выделения липидов из клеточной массы методом экстракции в неполярном растворителе (бензине или эфире). При этом получают одновременно два готовых продукта: микробный жир (биожир) и обезжиренный белковый препарат (биошрот).

Микроорганизмы - продуценты липидов

Сырьем для этого процесса являются те же среды, что и для производства кормовой биомассы. В процессе культивирования  микроорганизмов на различных средах получаются три класса липидов: простые, сложные липиды и их производные.                                                                                                     Простые липиды - нейтральные жиры и воски. Нейтральные жиры (основные запасные компоненты клетки) - эфиры глицерина и жирных кислот, основная масса которых триацилглицериды (есть, впрочем ещё и моно- диглицериды). Воски - эфиры жирных кислот или монооксикислот и алифатических спиртов с длинной углеродной цепью. По структуре и свойствам близки к нейтральным липидам. Наибольшее количество нейтральных липидов синтезируют дрожжи и мицелиальные грибы. Простые липиды находят применение как технологические смазки в процессах холодной и тепловой обработки металлов. Продуцентами сложных липидов являются в основном бактерии.                                                                                             Сложные липиды делятся на две группы: фосфолипиды и гликолипиды. Фосфолипиды (фосфоглицериды и сфинголипиды) входят в состав различных клеточных мембран и принимают участие в переносе электронов. Их молекулы полярны и при рН 7,0 фосфатная группа несет отрицательный заряд. Концентрат фосфолипидов находит применение в качестве антикоррозийной присадки к маслам и как добавка при флотации различных минералов. Гликолипиды в отличие от фосфолипидов не содержат молекулы фосфорной кислоты, но также являются сильнополярными соединениями за счет наличия в молекуле гидрофильных углеводных групп (остатков глюкозы, маннозы, галактозы и др.).                                                                                                                 К производным липидов относят жирные кислоты, спирты, углеводороды, витамины Д, Е и К. Жирные кислоты представлены насыщенными и ненасыщенными с одной двойной связью кислотами нормального строения и четным числом углеродных атомов (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая). Среди диеновых жирных кислот можно выделить линолевую. Двойные связи в ненасыщенных жирных кислотах микробных липидов часто располагаются так, что делят их на части, число углеродных атомов в которых кратно трем. Очищенные монокарбоновые кислоты с числом углеродных атомов 14-18 находят широкое применение в мыловаренной, шинной, химической, лакокрасочной и других отраслях промышленности.                  Спирты, присутствующие в липидах, делятся на три группы: спирты с прямой цепью, спирты с β-ионовым кольцом, включающие витамин А и каротиноиды, а также стерины - компоненты неомыляемой части липидов (например, эргостерин, облучение которого ультрафиолетовым светом позволяет получать витамин Д₂).

Питательные среды для  получения липидов

Итак, основную роль в процессе биосинтеза липидов играют различные штаммы дрожжей. Они используют те же источники  сырья, что и для получения  кормового белка, причем от ценности углеродного питания зависят  выход биомассы, количество и состав синтезируемых липидов. Для обеспечения  направленного биосинтеза липидов  в питательной среде употребляются  легкоассимилируемые источники  азота.                                                       На сдвиг биосинтеза в сторону образования липидов или белка влияет соотношение углерода и азота в среде. Так, повышение концентрации азота вызывает снижение липидообразования, а недостаток азота при обеспеченности углеродом ведет к понижению выхода белковых веществ и высокому процентному содержанию жира. Установлено, что оптимальное соотношение N:С тем меньше, чем труднодоступнее для дрожжей источник углерода. Обычно для углеводородного сырья соотношение N:C = 1:30, а для углеводного - 1:40. Накопление липидов возможно только при наличии в среде фосфора. При его недостатке источники углерода используются не полностью, при избытке - накапливаются нелипидные продукты. На фракционный состав липидов изменение содержания фосфора влияния не оказывает.                                                                                                                         Воздействие остальных элементов среды (микро- и макроэлементов) сказывается на интенсивности роста дрожжей и скорости утилизации источника углерода, что влияет и на количество накопленных липидов, но не на их качество.

3. Методы выделения целевых  биотехнологических продуктов

Завершающие стадии биотехнологических процессов – выделение целевого продукта – существенно различаются  в зависимости от того, накапливается  продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или  же продуктом является клеточная  биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть  их разрушению, а затем целевой  продукт очистить от остатков разрушенных  клеток. 
  Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах. 
Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта. 
Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная обработка реакционной смеси, способствующая более эффективному отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются различные методы сепарации. 
Флотация. Метод используется в том случае, если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. 
Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода является его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах. 
Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе – задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования. 
Центрифугирование. Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие. 
Центрифугирование и фильтрация в некоторых биотехнологических процессах осуществляется в комбинации, т. е. применяются фильтрационные центрифуги, в которых разделение жидкой и твердой фазы основано на двух процессах фильтровании и центрифугировании. 
Разрушение клеток проводится физическими, химическими и ферментативными методами. Наибольшее промышленное значение имеют физические способы дезинтеграции:  
1) ультразвуком; 
2) лопаточными или вибрационными дезинтеграторами – метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках;  
3) встряхиванием со стеклянными бусами;  
4) продавливанием через узкие отверстия под высоким давлением; 
5) раздавливанием замороженной массы;  
6)растиранием в специальных ступках;  
7) с помощью осмотического шока; 
8) многократным замораживанием и оттаиванием;  
9) сжатием клеточной взвеси с последующим резким снижением давления (декомпрессией). 
Физические способы дезинтеграции отличаются большей экономичностью в сравнении с другими методами, однако они характеризуются отсутствием выраженной специфичности, вследствие чего обработка может отрицательно влиять на качество получаемого целевого продукта. 
Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или получаемого в результате процессов дезинтеграции гомогената разрушенных клеток осуществляется путем осаждения, экстракции или различных методов адсорбции.  
Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание, разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое состояние. Естественно, что в зависимости от целей и свойств выделяемого продукта подбирается тот или иной метод и то или иное воздействие, т. е. подбирается реагент и т. п.  
Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из твердой фазы переходит в жидкую) и жидко-жидкофазную (когда обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также жидкую фазу).  
Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются различные органические растворители, в частности экстрагирование ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и белковых компонентов клеток. 
Адсорбция является достаточно распространенным методом отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. 
Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной фазы вещества поверхностью твердого тела. Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые глины и т. п. 
Более современные методы разделения веществ включают хроматографию, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции.  
Разделение веществ путем хроматографии основано на их неодинаковом распределении между двумя несмешивающимися фазами. Различают хроматографию на бумаге, пластинках и колонках. При хроматографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз является движущийся растворитель, а другой (неподвижной фазой) служат волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку какого-то материала (например, силикагеля). При колоночной хроматографии подвижной фазой является протекающий через колонку растворитель, а неподвижную фазу представляет заполняющий колонку адсорбент (чаще всего это гранулированный гель). Колоночная хроматография допускает масштабирование процесса, в результате чего она довольно широко применяется в промышленных условиях и включает несколько разновидностей: 
Ионообменная хроматография, колонка наполняется гранулами адсорбента, которые несут заряженные катионные (NH4) или анионные (SO4) группы, способные захватывать ионы противоположного заряда. Данный метод используется для выделения ионизированных веществ из жидкости, а также для очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы.