Современные методы этиологической лабораторной диагностики вирусных и бактериальных диарей

Современные методы этиологической лабораторной диагностики  вирусных и бактериальных диарей

 

Среди инфекционной патологии  человека значительное место занимают вирусные гастроэнтериты (ВГЭ). При  этом вклад вирусов в этиологическую структуру кишечных инфекций сопоставим с вкладом патогенных бактерий. Этиологическая структура вирусных гастроэнтеритов представлена ниже:

• ротавирусы – 40-45 % случаев;
• норовирусы – 15-20 %;
• коронавирусы и торовирусы – 12-15 %;
• астровирусы – около 10 %;
• аденовирусы – 2-5 %;
• пикорнавирусы – 1-2 %;
• парвовирусы – 0,5 %;
• саповирусы – 0,2 % случаев.

 

РОТАВИРУСЫ

Это РНК-геномные вирусы (род Rotavirus, семейства ReovIridae). По антигенным свойствам ротавирусы подразделяют на 9 серотипов: патогенны для человека серотипы 1-4 и 8-9, прочие серотипы (5-7) выделяют у животных.

Методы: электронная и  иммуноэлектронная микроскопия, метод заражения культур клеток, специфических антител и нарастания их титра в сыворотке крови больных и реконвалесцентов с помощью РН, РТГА и РСК. Первую сыворотку исследуют в первые 3-4 дня болезни, вторую ─ через 2 недели от начала заболевания, а также позднее. Серологическая диагностика носит ретроспективный характер, поскольку подтверждением диагноза считают ≥ 4-кратное нарастание титров антител в парных сыворотках, взятых в первые дни болезни и через 2 недели.

В начальной стадии заболевания  ротавирусы хорошо выделяются из фекалий. Для консервации кала готовят 10% суспензию в растворе Хенкса. Пробы испражнений помещают в стерильные флаконы, транспортируют в контейнерах со льдом.

Методы определения ротавирусов в клиническом материале:

• Реакция торможения гемагглютинации
• Иммуноферментный анализ
• Метод непрямой иммунофлюоресценции
• Реакция латекс-агглютинации
• Реакция непрямой гемагглютинации
• Реакция коагглютинации

Методы определения вирусоспецифических РНК

• Метод гибридизации
• Полимеразная цепная реакция

Методы определения антител  к компонентам ротавирусов

• Прямая электронная микроскопия
• Иммуноэлектронная микроскопия

 

ПАРВОВИРУСЫ

Возбудитель HboV-инфекции –  ДНК-содержащий вирус, принадлежит  к семейству Parvoviridae, роду Bocavirus. Анализ организации генома и аминокислотной последовательности кодируемых им белков позволил отнести вновь идентифицированный вирус к роду Bocavirus, в который входят 2 вируса: бычий парвовирус (bovine parvovirus - BРV) и минутный вирус собак (minute virus of canines - MVC). Таким образом, название рода бокавирус получено в результате комбинации первых двух букв «bo» из слова «bovine» и «ca» из слова «canine».

Известно два циркулирующих  генотипа бокавируса - ST1 и ST2, отличающихся друг от друга 26 синонимическими заменами в нуклеотидных последовательностях. Указанная изменчивость HBoV не соотносится ни с сезоном, ни с географическими регионами обнаружения  бокавируса , ни с клиническими проявлениями инфекции. В настоящее время накоплены сведения о циркуляции  бокавируса  в ряде стран мира, описана сезонность с пиком заболеваемости зимой и ранней весной. Трансмиссия (заражение) HBoV, как полагают, осуществляется преимущественно воздушнокапельным путем, но не исключается и алиментарный путь распространения вируса

Наиболее надежным методом  идентификации HBoV в клинических образцах является полимеразная цепная реакция.

КАЛИЦИВИРУСЫ

Калицивирусы, поражающие широкий спектр видов позвоночных животных, включая человека, были выделены из семейства Picornaviridae в 1979 г. В современной таксономии в семейство Caliciviridae входят 6 родов вирусов: Lagovirus, Vesivirus, Norovirus, Sapovirus, Recovirus, Nebovirus, различающиеся морфологией вирионов, структурной организацией генома и кругом хозяев. Патогенными для человека являются представители двух родов - саповирусы (род Sapovirus, типовой штамм - вирус Sapporo) и норовирусы (род Norovirus, типовой штамм - вирус Norwalk). В структуре калицивирусных инфекций на долю саповирус-ассоциированного гастроэнтерита приходится 5 - 10%, норовирусного - 90-95%.

На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей  генома норовирусы разделяют на пять геногрупп (GI - GV), из которых представители геногруппы I выделены исключительно от человека, III и V - только от животных, II и IV - от человека и животных (с сохранением гостальной специфичности).

Норовирусы человека не культивируются в лабораторных условиях. Обычно норовирус диагностируют по анализам полимеразной цепной реакции (ПЦР) либо по анализам ПЦР в реальном масштабе времени, которые показывают результат уже через несколько часов. Данные анализы достаточно чувствительны и могут определять концентрацию до 10 вирусных частиц. При этом стандартные методы определения наличия вируса в продуктах питания не всегда легко доступны из-за неоднородного происхождения разных продуктов, что влияет на концентрацию и экстрагирование вируса, и наличия факторов, которые делают методы анализа ПЦР (полимеразной цепной реакции) неэффективными.

Диагностические тест-системы  на основе ИФА или иммунохроматографии с выявлением антигенов норовирусов в фекалиях имеют более низкую диагностическую чувствительность. Применение данных тестов целесообразно только для установления этиологии групповых случаев заболеваний. Применение иммунохроматографических тест-систем рекомендовано исключительно в отсутствие необходимых условий в стационарной лаборатории. Методы электронной микроскопии (либо иммунной электронной микроскопии) вследствие высокой трудоемкости в настоящее время не находят широкого практического применения, представляя научный интерес.

Саповирусы являются вторым патогенным для человека родом семейства и характеризуются более высокой консервативностью генома по сравнению с норовирусами. Саповирусы чаще всего выявляются у детей младше 5 лет Согласно последней классификации саповирусов, основанной на филогенетическом анализе нескольких участков генома, выделяют 3 генотипа саповирусов. Только генотипы 1 и 2 саповирусов патогенны для человека. Генотип 3 саповирусов (porcine enteric calicivirus — PEC) поражает желудочно-кишечный тракт свиней и в отличие от других сапо- и норовирусов способен репродуцироваться в культурах клеток in vitro. Имеется предположение о способности калицивирусов образовывать рекомбинанты.

Для выявления вируса в  стуле в больничных лабораториях используют ОТ-ПЦР, иммуноферментный анализ (ИФА). Эти исследования вполне коммерчески доступны.

АСТРОВИРУСЫ

Семейство Astroviridae содержит два рода: Mamastrovirus, инфицирующие млекопитающих и Avastrovirus, инфицирующие птиц. Внутри родов виды называются согласно имени хозяина. Виды также разделяются на серотипы. На сегодняшний день идентифицировано 8 серотипов астровирусов, из которых только один серотип (HAstV-1) имеет существенное значение в развитии патологии человека.

Методы электронной микроскопии, ИФА, иммунофлуоресценции, ПЦР позволяют выявить вирусные частицы, антигены или нуклеиновые кислоты в фекалиях инфицированных людей. Метод ПЦР в реальном времени позволяет обнаружить все генотипы астровирусов человека.

КОРОНОВИРУСЫ

Семейство Coronaviridae включает в себя два рода: Сoronavirus и Тorovirus.

Toровирусы вызывают кишечные инфекции у позвоночных (животных и людей). Антигенная структура вируса сложная, отличается от таковой у вирусов, патогенных для животных. Выделяют 4 антигенные группы вируса: бычий (BToV), свиной (PToV), человеческий (HToV) и лошадиный (EToV). Антигенная разнородность возбудителей обусловливает высокую частоту реинфекций вирусом других серологических типов.

Тесты для диагностики  торовируса: ИФА для определения антител в образцах сыворотки (антитела против двуцепочечной РНК), а также RT-PCR в режиме реального времени для обнаружения и количественного определения в клинических образцах.

АДЕНОВИРУСЫ

Аденовирусы принадлежат к семейству Adenoviridae, включая род Mastadenovirus. Вирусная частица содержит ДНК, окруженную капсидом (белковой оболочкой). Известен 41 серотип аденовирусов человека. Серотипы 40 и 41 (кишечные аденовирусы) вызывают гастроэнтериты.

Диагностика большей частью, основывается на клинических проявлениях  и не требует лабораторного подтверждения. При необходимости, для подтверждения  недавно перенесённой инфекции используют серологическое тестирование (антитела к аденовирусу класса IgG и IgA) с использованием парных сывороток.

Антитела класса IgG к аденовирусу появляются через несколько дней после инфицирования. Концентрация их быстро растёт в период острой инфекции. После выздоровления специфические IgG циркулируют в крови длительный срок, свидетельствуя о перенесённой инфекции. При реинфицировании наблюдается выраженный рост концентрации специфических IgG. Для серологического подтверждения текущей аденовирусной инфекции используют метод парных сывороток – исследуют динамику концентрации IgG с интервалом 10 - 14 дней, значительный рост концентрации свидетельствует о свежей инфекции (чувствительность теста около 90%). Антитела против различных серотипов аденовирусов показывают высокую степень кросс-реактивности.

ПИКОРНАВИРУСЫ

На основании плотности  частиц, нуклеотидyого состава РНК и стабильности вирусов при разных рН семейство Picornaviridae разделено на 6 родов: Enterovirus, Parechovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus и Hepatovirus

Энтеровирусы включают 67 патогенных для человека серотипов:

• 3 типа вирусов полиомиелита,
• 23 типа вирусов Коксаки A,
• 6 типов вирусов Коксаки В,
• 31 тип эховирусов
• 4 типа энтеровирусов 68-71.

Описано 5 серотипов парэховирусов. Вирусы тропны ко многим клеткам организма, особенно к энтероцитам.

Наиболее часто острые кишечные инфекции вызываются вирусами Коксаки А-18, 20, 21, 22, 24; В – 2, 3, 4 и ECHO-сероварами 11, 14, 18. Клиническая диагностика энтеровирусных инфекций малодоказательна.

Лабораторная диагностика  включает: 1) вирусологические исследования — для определения в фекалиях вируса или вирусного антигена с  помощью электронной микроскопии  или методов иммуноэлектрофореза; 2) выделение вируса из клеток в смывах из зева и из фекалий; 3) серологические исследования (реакция нейтрализации вируса, РПГА, ИФА, латекс-агглютинация).

Лабораторная  диагностика вирусных гастроэнтеритов

Поскольку клиническая картина  при вирусных ГЭ отличается неспецифичностью, диагноз должен подтверждаться лабораторными исследованиями. Принципы диагностики вирусных ГЭ разрабатываются с момента расшифровки их этиологической структуры. Поскольку открытие вирусов произошло благодаря внедрению метода электронной микроскопии, именно этот метод длительное время оставался основным, а в некоторых случаях и единственным способом верификации диагноза вирусных ГЭ. Однако высокая стоимость проведения анализа и его относительно невысокая чувствительность потребовали разработки новых, более доступных методов верификации диагноза.

Основной причиной неудовлетворительной диагностики является отставание во внедрении в практику работы учреждений здравоохранения современных методов  диагностики актуальных ОКИ.

Критерии причастности вирусов к развитию гастроэнтеритов

• Значительно более частое обнаружение вируса в стуле больных 
  с диареей, по сравнению с группой здоровых лиц;
• Развитие специфической иммунной реакции организма на вирус в процессе заболевания;
• Установление факта санации организма от вируса в период выздоровления.

К сожалению, имеются реальные проблемы верификации вирусов у  больных с гастроэнтеритами, поскольку  единой методической «панели» исследования на различные вирусы сейчас не существует.

Наиболее подробно разработаны  методы диагностики ротавирусных инфекций. В зависимости от принципа, на котором основана диагностика, применяемые методы могут быть разделены на две группы: методы, основанные на определении самого вируса или его компонентов; методы, основанные на определении антител к компонентам ротавирусов.

Одним из наиболее перспективных  методов диагностики вирусных гастроэнтеритов  является полимеразная цепная реакция (ПЦР), чувствительность и специфичность которой оцениваются исключительно высоко. В научных исследованиях эти методы используются достаточно широко, однако пока ни один из них не зарегистрирован в нашей стране.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Brown DW, Gunning KB, Henry DM, et al. (January 2008). «A DNA oligonucleotide microarray for detecting human astrovirus serotypes». Journal of Virological Methods 147 (1): 86–92.
2. Guix S, Bosch A, Pintó RM (2005). «Human astrovirus diagnosis and typing: current and future prospects». Lett. Appl. Microbiol. 41 (2): 103–5.
3. Julkunen I., Lentomaki K., Hovi T. Immunoglobulin Class-Specific Serological Responses to Adenovirus in Respiratory Infections of Young Adult Men. J. Clin. Microbiol., 1986, Vol. 24, No. 1 p. 112 - 115.
4. Krishna NK (2005). «Identification of structural domains involved in astrovirus capsid biology». Viral Immunol. 18 (1): 17–26.
5. Lukashov VV, Goudsmit J (2002). «Evolutionary relationships among Astroviridae». J. Gen. Virol. 83 (Pt 6): 1397–405.
6. Madeley CR (1988). «Virus diarrhoea in hospital». J. Hosp. Infect. 12 (3): 145–9.
7. Madeley CR, Cosgrove BP (1975). «Letter: 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis». Lancet 2 (7932): 451–2.
8. Matsui SM, Kiang D, Ginzton N, Chew T, Geigenmüller-Gnirke U (2001). «Molecular biology of astroviruses: selected highlights». Novartis Found. Symp. 238: 219–33; discussion 233–6.
9. Prevention of Rotavirus Gastroenteritis Among Infants and children. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR), 2006/Vol.55/№ RR-12, August 11. P. 1–13.
10. Royuela E, Negredo A, Sánchez-Fauquier A (April 2006). «Development of a one step real-time RT-PCR method for sensitive detection of human astrovirus». Journal of Virological Methods 133 (1): 14–9.
11. Беляев А.Л. Вирусные гастроэнтериты как внутрибольничные вирусные инфекции // Здравоохранение. 2006. № 8. С.149–155.
12. Ковалева Е.П., Семина Н.А. Ротавирусная инфекция // Справочник госпитального эпидемиолога. М. 1999. С.157–158.
13. Львов Д.К., Колобухина Л.В. Ротавирусные инфекции // Медицинская вирусология / под ред. акад. РАМН Д.К. Львова. М.: Медицинское информационное агентство, 2008. С. 372–375.
14. Профилактика инфекционных болезней. Кишечные инфекции. Эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика норовирусной инфекции. Методические указания МУ 3.1.1.2969-11.
15. Профилактика инфекционных болезней: кишечные инфекции: эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика норовирусной инфекции. ─ Методические указания. ─ МУ 3.1.1.2969-11.
16. Ротавирусный гастроэнтерит. Методические рекомендации по эпидемиологии, диагностике, лечению и профилактике в Вооруженных силах Российской Федерации. МО РФ, Главное военно-медицинское управление (утверждены Начальником ГВМУ Минобороны РФ). 2000. С. 1–17.