Аллергологиядағы молекулалық зерттеу әдіс

                   

 

 

 

 

       Жоспары:

1. Аллергологияда қолданылатын . молекулалық генетикалық зерттеу әдістер әдістеі.............................................................................................3
2. Аллергологиялық аурулар кезінде болатын  гендік өзгерістер..........................................................................................................3
3. Бронх демікпесін анықтауда қолданылатын  молекулалық генетикалық зерттеу …………………………............................................................4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

І. Кіріспе

1, Молекулалық-генетикалық әдістер.

 Бұл әдістер ДНҚ  фрагментін талдауға , оның жеке  гендерін, сегменттерін тауып, бөліп  алуға мүмкіндік береді.

 Полимераздық тізбектік реакция

Соңғы жылдарда клиникалық практикада полимераздық тізбектік реакция әдісі кең қолданылып келеді (  ПЦР немесе Polymerase chain reaction, PCR diagnostics ). Бұл лабораторияға зерттеу үшін әкелінген әр түрлі биологиялық материалдағы инфекцияның қоздырғышын тікелей анықтаудың арнамалы және сезімталдығы жоғары әдіс болып табылады. Бұл қан, плазма, сарысу, зәр, қақырық, кез – келген биологиялық сұйықтықтар ( қуық асты безі сөлі, плевралық, жұлын ми, буындық сұйықтық, сілекей, асқазан сөлі, т.б.), асқазан, он екі елі ішек, аш ішек кілегейінің биоптаты, т.б.

Микробиологиялық зерттеу әдістерінен айырмашылығы, анализ генетикалық деңгейде жүргізіледі. ПЦР – технологиясы қолданылуының арқасында организмге енген микроорганизмнің ДНҚ бөлігінің сан алуан көшірмесін жасап шығаруға және анықтауға болады. Ол үшін зерттелетін сынамада арнамалы ДНҚ-ң 200 жұбымен бірге қысқа бөлігі болса жеткілікті.

 ПЦР әдісі принципі жайында алғаш рет 1983 жылы Кэри Маллис сипаттап жазды. Бұл молекулалық биология саласындағы ең жоғары жетістіктердің бірі болды. ПЦР – анализі әдісін ашқаны үшін Кэри Маллис 1993жылы химия саласындағы Нобель сыйлығына ие болды.

  ПЦР әдісі негізі болып термостабильді ДНҚ - полимераза ферменті көмегімен in vitro жасалған, қоздырғыштың ДНҚ бөлшегінің комплементарлық құрылымы табылады. Бұл фермент полимеразды тізбектік реакциясындағы барлық процесстерді «бақылауға» және катализдеуге мүмкіндік беретін, соның ішінде жоғарғы температурада өтетін керемет қасиеттерге ие болып келеді.

 Клиникалық үлгінің ПЦР анализі үш негізгі сатыдан тұрады:

а) ДНҚ немесе РНҚ – ны белгілеу;

б) ДНҚ фрагменттерінің амплификациясы;

в) ДНҚ өнімдерінің амплификациясы детекциясы ( нәтижелерді тіркеу ).

  Б і р і н ш і с а т ы д а зерттеу үшін алынған биологиялық материал арнайы өңдеуден өтеді, яғни сынамадан клеткалық материал, пептидтер, көмірсу, полисахаридтер мен белоктар жойылады, бірақ инфекция қоздырғышының арнамалы ДНҚ жіпшелері сақталып қалады. Бұл ПЦР анализдің келесі реакциясының «тазалығын» қамтамасыз етеді.

  К е л е с і с а т ы ДНҚ – матрица мен ДНҚ жіпшелерінің «құрылысы» (ұзаруы) үшін, талдау жасалатын үлгіге ДНҚ -полимераза ферменті, төрт түрлі мононуклеидтердің ( А, Г, Т, Ц ) жеткілікті мөлшерінен тұратын ерітіндіні қосу арқылы жүзеге асырылады. ДНҚ - матрица (праймерлер) – инфекция қоздырғышының жасанды жолмен синтезделген қысқа ДНҚ «бөлшектері», мұнда ДНҚ «клондалуы» жүзеге асырылады. Праймерлердің әрқайсысы ДНҚ фрагментінің бір ұшымен сәйкес келеді.

  ДНҚ - амплификатор деп аталатын арнайы құрылғыда, алынған үлгіні қыздырған кезде, екі спиральді нативті ДНҚ денатурацияға ұшырайды, яғни ДНҚ бір спиральді екі жіпшелерге бөлінеді. Үлгіні салқындатқан кезде осы жіпшелердің соңғы бөліктеріне праймерлер қосыла бастайды және ДНҚ - полимераза ферментінің арқасында үлгіде бар нуклеотидтерден ДНҚ – ң екінші спиралі құралады. Осылайша екі бірдей екі спиральді ДНҚ жіпшелері алынады.  

  ДНҚ синтезінің бірінші циклы аяқталған соң, қайтадан осы екі спиральдің термиялық денатурациясы басталады. Нәтижесінде төрт бірспиральді ДНҚ жіпшелері пайда болады, ал үлгі салқындаған кезде екі спиральді төрт ДНҚ жіпшелері алынады.

  Осылайша, амплификация циклын бірнеше рет қайталаған кезде, микроорганизмнің ДНҚ фрагменттерінің миллиондаған және миллиардтаған көшірмелері «клондалады». Кейін ол полиакриламидті, агарлы гельде электрофарез немесе иммуноферментті анализді қолданғанда ( ПЦР- анализдің ү ш і н ш і с а т ы с ы) идентификацияға ұшырауы мүмкін. Осы мақсатта амплификация өнімдерінің қоспасына ДНҚ фрагментіне «тігілетін» арнайы ерітінділер қосылады. Ерітінділер зерттелетін үлгіде вирус, микроб немесе бактерия ДНҚ-cы бар екендігін көрсететін флуоресциация қабілетіне ие болып келеді.

 

  

1-сурет.Амплификация тәсілі бойынша ДНҚ синтезделу үлгісі.

 

ПЦР негізгі артықшылығы анализ жасау уақытының жылдамдығы (2-3 сағат), диагностиканың арнамалығы және жоғары сезімталдығы болып саналады. ПЦР зерттеуге кез-келген зерттеу материалын, соның ішінде басқа зерттеу әдістерімен қолдануға келмейтін материалдар -  қақырық, кілегей, зәр, қан, сарысу, шәует, эпителий клеткаларының жағындысы, т.б. қолдана беруге болатындығы маңызды болып келеді.

 Нуклеин қышқылдарының  гибридизациясы әдісі. ДНҚ-ны рестриктазамен фрагменттерге бөлгеннен кейін, оларды полиакриламидті немесе агарлы гельде электрофарезден өткізеді. Содан соң, ДНҚ фрагменттерінің идентефикациясы жүзеге асады.

  ДНҚ арнамалы фрагменттерін анықтау үшін , Саузерн бойынша блотгибридизация әдісі қолданылады.

Сонымен қатар, Гатри бойынша микробиологиялық ингибиторлық тест, гибридизация әдістері, биохимиялық микробиологиялық экспресс- әдістер – флюорометриялық, хроматографиялық, радиоиммунологиялық, пренатальді диагностикалық әдістер де тұқым қуалаушылық ауруларды құрсақішілік ұрықтық даму кезінде уақытында анықтау үшін көп мағлұмат береді және қазіргі кезде кең қолданылып келеді.

 

2-сурет.ПЦР диагностикасы құрылғысы.

2. Атопиялық дерматит пен аллергологиялық аурулардың гендік өзгерістері.

Профиллагрин геніндегі  мутация филлагриннің өндірілуін тоқтатады, соның нәтижесінде әр түрлі популяциядағы  Аллергиялық дерматит пен басқа  да аллергиялық аурулардың дамуына  әкеледі. Мутацияның салдарынан терінің  қорғаныш қызметі төмендейді, осыған байланысты эпидермис арқылы аллергендер  денеге енеді де, жергілікті және жалпы  аллергиялық реакция дамиды (Palmer et al., 2006; Smith et al., 2006; Elias et al., 2008; Akiyama et al., 2010; Bonnelykke et al., 2010; Mildner et al., 2010; Poni?ska et al., 2011; Zhang et al., 2008, 2011; Kezic et al., 2011).

 

3, Бронх демікпесі кезінде тыныс жолдарының обструкциясы синдромымен көрініс береді және созылмалы персистирленген қабыну процессімен сипатталады. Қабыну эозинофильдік болып келеді және СD 4-лимфоциттермен бақыланады. Бронх демікпесі кезіндегі эозинофильдік қабыну кортикостероидтармеен оңай басылады.    

 Бронх демікпесінде  тыныс жолдарының құрылымдық  бұзылысы мен созылмалы қабынуы  қалыптасуында цитокиндер маңызды  орын алады. Қазіргі таңда цитокиндердің  50 жуық түрі анықталған, бірақ  олардың бұл аурудың патофизиологиясындағы  рөлі толық түсінікті емес.

  Қабыну медиаторлары бронх констрикцияның плазма экссудациясын , кілегей гиперсекрециясын, қабыну клеткаларының белсенділігін тудырады, коллаген талшықтары депозициясы нәтижесінде фиброз дамуына, бронх қабырғасының моноциттерінің гиперплазиясы мен гипертрофиясына әкеледі, кілегей асты қабатының бездерінің секрециясы жоғарылайды және тыныс жолдары қабырғасының иннервациясын бұзады.

  Атопия бронх демікпесі дамуында иммунопатология сияқты саналатыны белгілі. Атопиялық реакцияларда Т-хелпер клеткаларының 2 типінен өндірілетін интерлейкиндер маңызды рөл алады: IL-4, IL-5, IL-9 және IL-13. Аллергиялық реакциялардың туындауы негізінде Т- хелпер-2 типінің Т-хелпер-1 қарағанда басым болуы жатады. Осыған байланысты дисбаланс пайда болып, атопия дамиды.

  Тһ-2 тәуелді цитокиндер (IL-4, IL-5, IL-9,IL-13) гендер кластерін кодтайтын генетикалық локус 5-хромосоманың ұзын иығында (5q31.1-5q33) орналасқан.

  Аллергиялық қабыну дамуында Интерлейкин – 4 кілттік цитокин болып саналады.  Ол В – лимфоциттерді  IgE өндіруге бағыттайды,  тамыр эндотелийіндегі клеткалық адгезия молекулаларын белсендіреді, нәтижесінде Т-хелперлер, моноциттер, базофильдер мен эозинофильдер қабыну ошағына жиналады, сонымен қатар Тһ-2 лимфоциттер дифференцировкасы жүреді.

  Бронх демікпесі кезіндегі қабыну процессіне қатысатын көптеген медиаторлардың бірі болып қабынуға қарсы цитокин TNFα саналады. TNFα –ны нейтрофильдер мен альвеолалық макрофагтар өндіреді. Олар интерлейкиндер каскады (IL-1, IL-6, IL-8) инициациясында маңызды рөл атқарады. TNFα оксидативті стресс дамуындағы рөлі индуцибельдік NO-синтаза (iNOS2) белсенсендіруге қатысады. TNFα гистосәйкестіліктің басты комплексінің ІІІ классы деңгейінде 6-хромосоманың қысқа иығында орналасқан (6р21.3).

  Бронх демікпесінің дамуына әкелетін цитокин гендерінің (IL4, TNFα) әсері мен рөлі жайында қазақ популяциясы арасында мынадай зерттеу жасалған. Зерттеуге Астана қаласының Онкологиялық  диспансерінің пульмонологиялық бөлімшесінде Бронх демікпесімен емделіп жатырған 58 науқас қатысқан. Олардың 35-і (60,3%)  ер адамдар және 23-і (39,7%) әйел адамдар болған. Жас айырмашылығы 32-78 жас аралығында болған.  Бронх демікпесінің клиникалық диагнозы БД емдеу мен алдын-алудың Әлемдік стратегиясына сәйкестендіріліп лабораторлық, инструментальді, рентгенологиялық зерттеулермен дәлелденген. 44 науқас персистирленген орташа ағымды астма, ал 14 науқас ауыр ағымды персистирленген астмамен ауырған.

Зерттеу жүргізуге материал ретінде қан алынған және Ісік некрозы факторы (TNFα) , интерферон-g(ИНФ-g), интерлейкиндер 4, 2, и 10 (IL4, IL2 и IL10), қан сарысуындағы жалпы иммуноглобулин Е (IgE) иммуноферменттік әдіспен анықталған.

  IL4 гені -589С/Т және IL5 гені -  709C/T полиморфизмін зерттеу үшін полимераздық тізбектік реакция әдістері қолданылған.

Реакция өнімдерін 3% агарлы гельде және кейін борлы этидиймен  өңдеу арқылы электрофараз әдісімен талдау жасаған.

Зерттеу қорытындысы бойынша, науқастардың қан сарысуынан жалпы  иммуноглобулин Е көп мөлшерде табылды. IL-4/ g-INF цитокиндер қатынасын талдау кезінде Тһ-2 лимфоциттер белсенділігі жоғары екендігі анықталды.  ТNF–α БД ауыр ағымында жоғары деңгейде болған.

  Алынған мәліметтерге сүйене отырып, қазақ популяциясы арасында ТNF–α генінің 308-А –генотипі бар адамдар бронх демікпесімен ауыру қаупі жоғары екендігі анықталды. Бақылау тобымен салыстырғанда, яғни дені сау адамдарға қарағанда БД ауыратын адамдардың қан сарысуында  IL-2, IL-4, TNF-α, IL-10 деңгейі жоғары болады.

Ресей зерттеушілері аллергиялық  аурулармен ауыратын адамдар мен  сау адамдарды екі топқа бөліп, европалық популяциядағы кең  таралған екі ген FLG - с.2282del4 (c.2282delAGCT) және  p.Arg501Ter (p.R501X) зерттеген.  с.2282del4 гені мутациясының гетерозиготты тасымалдаушылары  бақылау тобының 3,86% сәйкес келеді. Аллергиялық аурулардағы с.2282del4 аллелі делециясы жиілігі 4,34% , ал бақылау  тобында  - 1,93% (p=0,0033; OR=2,31 (CI95%1,3-4,09)) құрады. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                        

                          

 

 

 

 

    

              

 

      Пайдаланылған әдебиеттер:

 

 

• Зайцева О.В., Лаврентьев А.В., Зайцева С.В., Самсыгина Г.А.

Интерлейкин-1 альфа, фактор некроза опухолей-альфа и интерферон-

гамма в сыворотке крови  у детей при бронхиальной астме  в различные периоды заболевания. Аллергология 2000; 3: 8-13.

• Латышева ТВ., Варфоломеева М.И., Удалова В.А. и др. Взаимосвязь

дисбаланса ТМ1- и Тh2-лимфоцитов и формы бронхиальной астмы.

Иммунология 2005; 3: 164-167.

• Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пузырев В.П.

Генетика атопии: современное состояние. Вестник ВОГиС 2006; 10(3):

492-502.

• Хаитов Р.М. Клиническая аллергология. М. 2002. – С. 175-191.
• Интернет желісі. www.google.ru
• www.yandex.ru