Выполнил: студент 104 группы лечебного факультета

Телегин Иван

Проверила: Задорожная А.Н.

Содержание:

1. Введение
2. Основная часть

1. Современные физико-химические методы анализа

1. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс-минус"
2. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод "терминаторов"
3. Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации
4. Автоматическое секвенирование ДНК

3. Заключение

4. Литература

  ВВЕДЕНИЕ           

Определение первичной  структуры белков сводится к выяснению  порядка расположения аминокислот  в полипептидной цепочке. Эту  задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence последовательность).

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет  определить аминокислотную последовательность а полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом  определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам: 
1) Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования. 
2) Секвенирование каждого из полученных фрагментов. 
3) Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Основная  часть

1.1 Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс-минус"

Первым методом прямого ферментативного секвенирования ДНК стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.

1.2 Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод "терминаторов"

В 1977 г. автор "плюс-минус" метода предложил еще один способ ферментативного секвенирования, получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В основе метода тоже лежало ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

1.3 Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации

 В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента. 
 

1.4 Автоматическое секвенирование ДНК

В основе автоматического секвенирования лежит  уже упоминавшийся выше метод  ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP(*). Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки.

Флуоресцентную  метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые  терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод Максама-Гилберта и метод Сэнгера основаны на одном  принципе. В первом используется специфическое  расщепление ДНК, обусловленное  природой оснований, во втором - статистический синтез ДНК, заканчивающийся на каком-либо одном из 4 нуклеотидов. Таким образом, основой обоих методов является получение полного (статистического) набора фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырёх нуклеотидов.

Химический метод (метод Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исследуемая ДНК не слишком велика (200-500 звеньев). В том случае, если речь идет о секвенировании высокомолекулярной ДНК, лучше применять метод полимеразного копирования (метод Сэнгера) , чтобы не вводить процедуру рестриктазного расщепления с выделением индивидуальных фрагментов. При энзиматическом секвенировании протяженных одноцепочечных ДНК (например, бактериофагов) можно применять набор олигонуклеотидов-затравок, синтез которых в настоящее время не требует больших затрат времени и труда. Для двутяжевых высокополимерных ДНК наиболее удобен метод слепого энзиматического секвенирования с применением универсальной затравки (их выпускают многие фирмы) и обработки данных с помощью ЭВМ. Химический метод также может быть применен, но в этом случае необходимо вырезать из вектора исследуемые фрагменты ДНК, и это усложняет всю процедуру.

Секвенирование  нуклеиновых кислот в настоящее  время стало рутинным методом  молекулярной биологии. Несомненно, в  ближайшем будущем появятся еще более совершенные автоматические секвенаторы, что приведет к резкому увеличению числа расшифрованных последовательностей. Благодаря знанию генетического кода появилась возможность определять участки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потенциальные белки. Этот источник и сегодня дает нам основную информацию о функциональном строении нуклеотидной последовательности. 
 

Литература 

1. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. С англ. / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – М. : Мир, 1999.
2. Шабарова З. А. , Богданов А. А. Химия нуклеиновых кислот и их компанентов. – М. : Химия, 1978.